5目的基因.ppt

基因工程;第五节 目的基因;转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或TAA或TGA)、终止转录区 （1）原核生物基因的组成 基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物： 5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。 原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。 ;基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。 编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)： 与RNA聚合酶结合有关 -75区上游有一共有序列GGGCGC (GC框):结合某些转录因子 转录终止区: （3）其他基因组基因的组成 质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。;;一、目的基因的来源;二、获得目的基因的途径;二、获得目的基因的途径;1、目的基因的化学合成;;1、目的基因的化学合成;（3）应用范围;（4）常用的方法;;;化学合成法的最大优点是能按照人们的意愿合成突变基因。但有局限性，要合成较长链的 DNA分子尚有困难。 随着现代科学技术的发展，基因工程操作仪器设备也不断更新。如日本Zeon公司已成功制成并出售“全自动DNA合成仪” ，精工电子工业公司的“ DNA序列仪”。 目前单链DNA短片段的合成已经成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术了。;2、PCR扩增目的基因;2、PCR扩增目的基因;2、PCR扩增目的基因;2、PCR扩增目的基因;3、限制酶酶切直接分离目的基因;对已测定了核苷酸序列的 DNA分子，根据已知的限制性内切核酸酶识别序列只需要用相应的限制性内切核酸酶进行一次或几次酶切，就可以分离出含目的基因的 DNA片段。 ;3、限制酶酶切直接分离目的基因;4、通过基因组文库分离目的基因;4、通过基因组文库分离目的基因;构建基因组文库全过程;1） 分离纯化基因组DNA：提取哺乳动物细胞染色体DNA 2）制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂法：用超声波或高速搅拌DNA溶液，断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 插入载体之前还需要进行修饰加工，少用。 ②限制酶降解（鸟枪法）：过去用EcoRⅠ,现用Sau3A。断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可直接与处理过的载体连接。;鸟枪法（shotgun approch）：;（3）构建基因组文库全过程;（4）基因组文库大小的计算;（4）基因组文库大小的计算;; 用于构建基因文库片段的产生大致有两种方法： 一是用限制性内切酶完全消化基因组DNA，这个方法有两个特点。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即46＝4096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。 ; 用于制备基因文库的随机片段的另一种方法是采用机械随机切割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb ），从而克服上述的两处缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体ＤＮＡ进行连接。 用于基因文库构建的载体常用噬菌体λ或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然cosmid载体比λ载体的容量大，但由于文库的保存（cosmid载体在E.coli中， λ载体在噬菌体中） λ比cosmid容易，因此λ载体用的更多些。;限制酶切位点; 有一些序列不能被克隆 Example: 1. 序列缺乏酶切位点; 2.目的基因包容在一个其大小范围超出载