目的基因的获取.ppt

mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物第63页,共78页，星期六，2024年，5月第64页,共78页，星期六，2024年，5月在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。（4）cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶第65页,共78页，星期六，2024年，5月第66页,共78页，星期六，2024年，5月4.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N=ln(1-p)ln(1-)1nP:文库包含了完整mRNA的概率（99%）N:所需的重组载体数（克隆数）1n第67页,共78页，星期六，2024年，5月cDNA文库构建的实例第68页,共78页，星期六，2024年，5月第69页,共78页，星期六，2024年，5月三、cDNA和基因组文库的区别第70页,共78页，星期六，2024年，5月第71页,共78页，星期六，2024年，5月GenomeDNAlibrary基因组DNA生物体的每个gene有一个clonecDNAlibrarymRNA只包含生物体特定组织、特定发育阶段表达的gene出发材料：所包含gene:第72页,共78页，星期六，2024年，5月（一）cDNA文库1.cDNA文库的优点②可用于RNA病毒的文库构建，为什么？①文库的筛选比较简单易行第73页,共78页，星期六，2024年，5月2.cDNA文库的特殊用途①克隆在细菌中表达的基因②基因序列结构的测定真核生物基因的间隔子DNA序列在与其基因对应的细胞质mRNA中是不存在的，具有不间断的mRNA拷贝的cDNA可用于细菌中表达可有效地用于分析间断基因的结构。在已知基因组DNA序列的情况下，通过cDNA比较，可以研究出间隔子和表达子间的界线。③用于分离组织或发育阶段特异性基因第74页,共78页，星期六，2024年，5月3.cDNA文库的局限性①只反映mRNA的分子结构，只克隆具有蛋白质产物的结构基因和调节基因；不能克隆基因组DNA中的非转录区段的序列，没有包括基因组DNA的间隔序列③不利于低丰度mRNA的cDNA的克隆②受细胞来源或发育时期的影响，cDNA文库所包含的遗传信息远远少于基因组DNA文库第75页,共78页，星期六，2024年，5月（二）基因组DNA文库1.基因组DNA文库的优点①更有效地用于真核细胞中表达外源的真核基因②克隆的是全部遗传信息，不受时空的影响③克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列第76页,共78页，星期六，2024年，5月2.基因组DNA文库的局限性①不能用于不经过DNA中间体的RNA病毒的克隆②筛选的克隆数多，工作量大,直接分离目的gene的DNA序列非常困难第77页,共78页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第78页,共78页，星期六，2024年，5月第31页,共78页，星期六，2024年，5月4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N:所需的重组载体数（克隆数）基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式：第32页,共78页，星期六，2024年，5月例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大小；f:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第33页,共78页，星期六，2024年，5月第34页,共78页，星期六，2024年，5月5.基因组文库的扩增及保存（1）基因组文库的扩增①液体培养增殖法最简便混合培养方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细