目的基因获取.解读.ppt

第四章 目的基因的获得 目的基因 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。 编码某种蛋白质 研究某基因结构和功能的关系 研究某基因与疾病的关系 一、基因的基本结构特征 一个能转录、翻译的结构基因依次包括以下几部分：转录启动区、核糖体识别区、编码区(包括起始密码子ATG、开放阅读框、终止密码子TAG、TAA或TGA)和转录终止区。 （一）原核生物基因的组成——操纵子 启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段； SD区：糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置； 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。 原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。 基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区：TATAA/TA区（Hogness框）、 CAAT框、GC框。 转录终止区:真核生物转录的终止信号并不清楚。 （二）真核生物基因的组成 二、目的基因的获得方法 目前克隆目的基因常用的方法有四种方法：化学合成法、cDNA文库法、PCR法和RT-PCR法 。 将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直接合成。 特点：①只能合成小于100个碱基特定序列；②自动化程度较高；③合成速度较快。 方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法 （一）化学合成法 化学合成法的用途 合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等 修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 设计新型基因 制备探针、引物、接头 （二）cDNA文库法 cDNA (complementary DNA，互补DNA)：由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。 cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 构建cDNA文库的一般步骤 总RNA（total RNA）提取 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。 mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料 2. mRNA的分离纯化 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 方法：亲和层析。分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 3. cDNA第一链的合成 Oligo dT法：用Oligo dT作引物，合成cDNA的第一链。 反转录酶 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 不适用于大分子量的mRNA 随机引物法：随机合成6-10bp的多种引物，从mRNA的多个位点开始合成cDNA。 基因特异性引物法：mRNA序列已知，设计基因特异性引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。 4. 降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 3’ 引物 mRNA mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 5’ cDNA第一链 3’ 5’ 引物 或RNaseH 碱 5. cDNA第二链的合成 自身引导法用RnaseH 消化后，cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。 S1核酸酶消化会使获得的双链cDNA 5’端有几对碱基缺失 置换合成法 以第一链合成产物cDNA-mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链. 置换合成法 6. cDNA与载体连接 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 cDNA文库的查询 用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。 文库 载体 探针 电泳后杂交放射自显影 测序分析 （三）PCR法 目前实验室最常用。 扩增时容易突变：高保真的PCR引物，DNA