第五章目的基因的获取讲课.ppt

3、亚磷酸三酯法 如此经过多次循环，直到合成所需长度为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上洗脱下来，最后除去NH4OH ，在真空中抽干，样品即可溶于适量的水中进行纯化分析。 (2)盒式PCR 原理 (3)RACE技术 3`-RACE原理 5`-RACE原理 高特异性的5’-RACE原理 三、转座子标签法 四、图位克隆法 1、染色体步移 2、染色体登陆 2、染色体登陆 目的基因 的引物1 反转录成目的基因cDNA第一链 目的基因 的引物2 目的 基因cDNA第二链 PCR mRNA (二)未知目的基因序列 （1）反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列 把线性DNA模板转变成环形分子。 template template 3’ 5’ 5’ 3’ （传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。 技术关键： 使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。 盒式PCR （Cassette PCR） 是利用Cassette(人工合成的带有适当限制性内切酶粘末端较长的双链DNA分子)和Cassette 上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法。 首先用适当的在已知DNA区没有识别位点的酶切割，产生含上下游未知区域DNA分子，然后与含有对应限制酶切位点的Cassette进行连接，接着用Cassette 引物1（C1）和根据已知区域设计的特异引物1（S1）进行第一次扩增，最后用 Cassette 引物2（C1）和根据已知区域设计的特异引物2（S2）进行第二次扩增。在设计上Cassette的5`端为-OH，所以目的DNA的3`末`端和Cassette的5`末端连接部位形成缺口。因此第一次PCR反应从引物C1开始延伸反应在连接部位终止，控制了非特异性扩增。只有从引物S1延伸合成的DNA链，才能成为引物C1的模板，进行扩增反应。再用内侧引物（C2，S2）进一步进行巢式PCR，高效特异地扩增目的DNA未知区域。 RACE（Rapid Amplification of cDNA ends）是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA 第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3`或5`之间的未知序列的方法,分别称为3`-RACE或 5`-RACE。 锚定(Anchored PCR)和反向PCR都可以用于RACE技术，经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计的，而高特异性的RACE是借助于反向PCR技术。 TTTTT-Q1-Q0 5` AAAAA3` QT TTTTT-Q1-Q0 第一链cDNA QT 第一次扩增 GSP1 Q0 第二次扩增 Q1 GSP2 反转录 图 经典3`-RACE 第一链cDNA 5` 3` ORF GSP-RT GSP-RT 逆转录 cDNA 加尾 第一链cDNA GSP-RT AAAA 第一次扩增 Q1-TTTT AAAA 第二次扩增 Q1 图 经典5`-RACE GSP1 GSP2 高特异性的RACE基于反向PCR扩增技术,它利用已知序列内部高特异性的嵌套引物进行扩增的原理，故具有较高的特异性。 A A A A A A3’ 已知序列 Pi 5’端磷酸化特异引物 逆转录 A A A A A A3’ 已知序列 RNaseH降解掉mRNA T4RNALigase环化单链cDNA A2 A1 S1 S2 PCR1 A1、S1 PCR2 S2、A2 转座子是一类可以在同一条染色体不同位点或不同染色体间转移的一段特殊的DNA。 原 理 转座子插入 基因失活或突变 构建纯合突变株基因组文库 转座子为探针 筛选出包含目的基 因片段的阳性克隆 目的基因 片段为探针 筛选野生型的植株 构建的基因组文库 测序 目的基因标签法 × 转座子 导入 (含转座子的显性纯合体) A A* （隐性纯合体）a a (显性表型)Aa （突变或隐性表型 ）A*a 自交 aa A*a （突变纯合子）A*A* 建基因文库 目的基因对应的显性隐性性状个体都有 非目的基因标签法 × 转座子 导入 (含转座子的显性纯合体) A A* （显性纯合体）AA （突变或显性表型 ）A*A 自交 AA A*A （突变纯合子）A*A* 建基因文库 （显性纯合体）AA 关注的是一群因转座子插入