哺乳动物细胞表达系统研究进展.PDF

书中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（１）：９５１００ ＤＯＩ： 檪檪檪檪檪檪檪檪檪 檪 檪檪檪檪檪檪檪檪 檪 檪 殏 殏 殏 殏 １０．１３５２３／ｊ．ｃｂ综　　述 哺乳动物细胞表达系统研究进展 李国坤１　高向东１　徐　晨２ （１中国药科大学生命科学与技术学院　南京　２１０００９　２北京三元基因工程有限公司　北京　１０２６００） 摘要　目前，哺乳动物细胞已成为生产多种生物药物的首选宿主细胞。哺乳动物细胞表达系统 可进行翻译后修饰，表达的重组蛋白接近人源构象，因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产，如 何建立高效的哺乳动物细胞表达系统也受到研究者们的重视。随着基因组学、转录组学、蛋白质 组学以及代谢组学研究不断深入，近几年来在优化哺乳动物表达系统方面取得了长足的进步。 从高效表达载体构建、宿主细胞改造、高通量筛选、培养基优化等方面阐述哺乳动物细胞表达系 统的研究进展，以期为研究者们提供一定的帮助。 关键词　高效表达载体　染色质开放元件　宿主细胞改造　高通量筛选培养基优化 中图分类号　Ｑ９５２ 收稿日期：２０１３１１０６　　修回日期：２０１３１２１０  通讯作者，电子信箱：ｘｕｃｈｅｎ＠ｔｒｉｐｒｉｍｅ．ｃｏｍ 　　１９８６年，ＦＤＡ批准了世界上第一个来源于重组哺 乳动物细胞的治疗性蛋白药物———人组织纤溶酶原激 活剂（ｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔＰＡ），这标志 着哺乳动物细胞作为治疗性重组蛋白的工程细胞得到 ＦＤＡ认可。已上市及在研的重组蛋白药物，多为糖基 化蛋白药物。对于需要糖基化以保持活性的复杂蛋 白，哺乳动物表达系统由于具有与人相似的糖基化模 式及某些优势受到人们的重视。２０１１至 ２０１２年 ＦＤＡ 共批准上市１２个生物药物，过半数由哺乳动物细胞生 产［１２］。目前，哺乳动物细胞表达系统仍然存在着蛋白 表达量低、细胞株稳定性不足、成本较高的缺陷，随着 大批专利药物到期、在研药物不断增加，生物医药产业 的竞争愈加激烈，改进哺乳动物细胞表达系统提高表 达水平，降低单位生产成本的重要性日益显著。本文 着眼于高效表达载体构建、宿主细胞改造、筛选策略等 方面对重组蛋白在哺乳动物细胞表达系统中的高效表 达研究进展做综述。 １　高效表达载体构建 　　构建高效表达载体被认为是提高重组蛋白表达水 平的主要手段。载体构建策略常以提高重组蛋白表达 水平，增加工程细胞稳定性为主要目标，例如：引入共 扩增基因、采用不同的表达调控元件组合、弱化筛选标 记、改变基因排列方式等。 １．１　基因扩增系统 　　在宿主细胞内扩增目的基因被认为是提高表达水 平的重要策略之一。目前最常用的基因扩增系统是二 氢叶酸还原酶（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ｄｈｆｒ）系统。该 系统是将目的基因和 ｄｈｆｒ基因同时或分别转染 ｄｈｆｒ细 胞，然后加入氨甲喋呤（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，ＭＴＸ）加压扩增， 最终目的基因得到大量扩增。目前，ｄｈｆｒ系统的技术较 为成熟，Ｓｏｕｄａｂｅｈ等［３］采用 ｄｈｆｒ系统表达曲妥单抗，总 单抗效价高达５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ。研究者们也在不断探索新 的途径去提高该系统的蛋白表达水平。比如 Ｌｅｅ等［４］ 通过控制细胞周期检查点来提高 ｄｈｆｒ基因扩增系统的 效率，发现可以提高定容产率约３倍。 　　另一个比较成熟的系统是谷氨酰胺合成酶 （ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＧＳ）系统。ＧＳ系统广泛用于 ＧＳ 内源性表达水平很低的 ＮＳ０和 ＣＨＯ细胞，尤其是 ＮＳ０ 细胞；细胞转染 ＧＳ及目的基因后，使用无谷氨酰胺培 养基，并 加 入 蛋 氨 酸 亚 氨 基 代 砜 （ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ，ＭＳＸ）加压筛选，使目的基因大量扩增。 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３４Ｎｏ．１２０１４ Ｆａｎ等［５］发现敲除 ＣＨＯ细胞的 ＧＳ基因可提高高产细 胞株所占比例６倍、大批培养产量２倍。然而，ＧＳ系统 也存在一些缺陷，比如在一定传代数量之后细胞株表 现出不稳定性，蛋白产量会有所下降。但 Ｂａｉｌｅｙ等［６］ 的研究表明 ＧＳＣＨＯ细胞株表达稳定性可以保持４０～ ５０代，之后抗体产量下降４０％． １．２　克服位置效应 　　目前，目的基因整合进入宿主细胞基因组常采用 随机整合。该方法导致外源基因插入染色体的位置、 拷贝数、表达水平等情况都不可预知。染色体上外源 基因插入区域的状态会影响其表达，即所谓的位置效 应（ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｆｅｃｔ）。克服位置效应目前主要有两种策 略。第１种策略是在外源基因两端引入某些转录调控 元件，开放插入区域的异染色质或阻止其对插入基因 的影响