《哺乳动物细胞表达系统》课件.ppt

哺乳动物细胞表达系统高效生产复杂蛋白质的优选平台

课程目标了解哺乳动物表达系统基础原理掌握系统组成与工作机制熟悉关键细胞系特点比较不同细胞系优缺点掌握优化策略提高蛋白表达量和质量了解应用前景

目录1第一至三部分系统概述、优势和常用细胞系2第四至六部分基本原理、表达策略和细胞培养3第七至九部分优化策略、纯化技术和质量控制4第十至十一部分挑战、解决方案和未来发展

第一部分：哺乳动物细胞表达系统概述定义与特点利用哺乳动物细胞生产复杂蛋白质发展历史从实验室技术到工业规模生产应用领域生物制药、疫苗、基础研究系统组成细胞、载体、培养条件和表达策略

什么是哺乳动物细胞表达系统？基本定义利用哺乳动物细胞作为宿主表达外源基因编码的蛋白质获得具有天然结构和功能的产物系统组成细胞宿主表达载体培养基系统转染/转导方法关键特点复杂糖基化修饰能力正确蛋白质折叠完整翻译后加工高生物活性产物

哺乳动物细胞表达系统的发展历史11950年代首次建立连续培养细胞系21970-80年代杂交瘤技术和首批单抗药物31990年代无血清培养和悬浮培养技术成熟42000年至今基因工程、高效表达和大规模生产

哺乳动物细胞表达系统的重要性产业价值全球生物制药市场核心技术产品质量生产功能完整的人源化蛋白3技术基础实现复杂蛋白的工业化生产

哺乳动物细胞表达系统的应用领域3单克隆抗体癌症和自身免疫疾病治疗疫苗开发病毒样颗粒和亚单位疫苗基因治疗病毒载体生产基础研究蛋白质结构和功能研究

第二部分：哺乳动物细胞表达系统的优势复杂翻译后修饰实现人源化糖基化模式正确蛋白质折叠复杂结构域的精确构象高效分泌能力分泌型蛋白的天然加工高质量终产品生物活性和安全性保障

优势1：翻译后修饰复杂糖基化N-连接和O-连接糖基化蛋白质剪切正确信号肽切除二硫键形成复杂三级结构的稳定磷酸化等修饰功能调控的关键

优势2：蛋白质折叠分子伴侣辅助热休克蛋白和折叠酶协助内质网环境专业化折叠环境二硫键形成蛋白质结构稳定化

优势3：分泌能力信号肽识别靶向内质网转运内质网加工糖基化和初步折叠高尔基体修饰糖链加工和蛋白质分选分泌囊泡运输向细胞外释放成熟蛋白

优势4：产品质量高生物活性保持天然构象和功能低免疫原性人源化修饰降低排斥风险结构完整性完整多聚体装配能力批次一致性稳定细胞系确保产品一致

第三部分：常用哺乳动物细胞表达系统主流哺乳动物细胞表达系统包括CHO、HEK293、BHK、NS0/SP2/0等

CHO细胞系来源中国仓鼠卵巢细胞优势高产量、易培养、安全记录良好应用抗体生产、凝血因子、生长因子特点悬浮培养能力、适应无血清培养产量水平可达5-10g/L

HEK293细胞系人源背景人胚肾细胞，人源糖基化模式高转染效率适合瞬时表达和病毒包装易于培养贴壁和悬浮培养均可应用范围复杂蛋白、病毒、基因治疗载体

BHK细胞系来源婴仓鼠肾细胞特点高表达某些复杂蛋白，如凝血因子应用第Ⅷ、Ⅸ凝血因子和疫苗生产局限性对某些病毒易感，安全性考量

NS0和SP2/0细胞系NS0细胞系小鼠骨髓瘤细胞无内源性抗体表达适合单抗生产胆固醇依赖性SP2/0细胞系小鼠杂交瘤细胞历史悠久的抗体表达平台生长速度快糖基化模式与人源差异较大共同特点无血清适应性悬浮培养能力FDA批准应用历史抗体表达的经典细胞系

其他哺乳动物细胞系12345PER.C6人视网膜细胞，高密度培养能力CAP人羊膜细胞，悬浮生长，高表达量C127小鼠乳腺上皮细胞，特定蛋白表达COS猴肾细胞，高效瞬时表达Vero猴肾细胞，疫苗生产应用

第四部分：哺乳动物细胞表达系统的基本原理基因设计目的基因和调控元件基因递送转染或病毒转导细胞表达转录、翻译和修饰筛选扩增高表达克隆选择

基因转染脂质体转染脂质-DNA复合物介导简便高效，适用多种细胞电穿孔法电脉冲形成瞬时膜孔适用难转染细胞病毒转导慢病毒、腺病毒等高效率，可整合聚合物转染PEI、磷酸钙沉淀经济实用

表达载体设计1目的基因编码目标蛋白启动子/增强子驱动高效转录标签序列辅助纯化和检测选择标记筛选转染细胞调控元件多顺反子和信号序列

启动子选择启动子类型特点应用场景CMV强启动子，组成型表达高水平表达，短期表达EF1α中强度，长期稳定稳定细胞系建立CAG组成型，广谱活性多种哺乳动物细胞PGK中等强度，稳定性好长期表达应用诱导型启动子可调控表达水平毒性蛋白表达

选择标记48h筛选时间转染后开始药物选择2-3周克隆形成稳定整合细胞克隆出现4-8周稳定细胞系单克隆扩增完成时间常用选择标记包括：G418(新霉素)、嘌呤霉素、潮霉素B、氨甲蝶呤

第五部分：表达策略瞬时表达快速获得蛋白无需细胞筛选表达时间短(3-14天)产量较低稳定表达长期持续表达需克隆筛选建系时间长(1-3个月)产量高，批次一致诱导表达可控表达时间调节表达水平适合毒性蛋白系统复杂度高

瞬时表达1转染优化高