高等动物基因哺乳动物表达系统.ppt

3.通过翻译增强子提高翻译效率翻译增强子是具有与IRES不同二级结构的另一类提高翻译起始效率的顺式调控元件。1998年stein等发现在组织缺氧情况下VEGFmRNA寿命大为提高。VEGF翻译增强的程度可高达40倍，由此发现了翻译增强子。第64页,共86页，2024年2月25日，星期天（1)利用密码子的偏好性根据密码子的偏好性，在不改变蛋白质编码序列的前提下尽量使用CHO细胞常用的密码子对基因进行改造实例：Kim等用人高表达基因偏爱的密码子系统地设计了人的EPO基因，再以酵母偏爱的密码子编码人的EPO基因作对照来比较优化后的人EPO基因的表达效率。结果表明，优化的人EPO基因密码子比非优化的人EPO基因密码子的表达效率高2－3倍。二、基因改造第65页,共86页，2024年2月25日，星期天（2)尽量使用基因组DNA基因组DNA比cDNA表达量要高。因此，在可能的条件下，尽量使用基因组DNA。若用cDNA，则尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5′未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响。第66页,共86页，2024年2月25日，星期天三、宿主改造（1）增强CHO细胞抗细胞凋亡活性；（2）使CHO细胞可在无血清培养基（PFM）中自分泌生长；（3）减少CHO细胞中有害代谢物的产生；（4）控制CHO细胞增殖速率；第67页,共86页，2024年2月25日，星期天迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：b干扰素 g干扰素凝血因子VIII 凝血因子IX促红细胞生成素（EPO） 人生长因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原单克隆抗体 CD4受体组织型纤溶酶原激活剂（tPA） （2）利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的实例第68页,共86页，2024年2月25日，星期天1.利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体大多数恶性淋巴Neor鼠金属硫蛋白启动子b肌动蛋白启动子抗体轻链cDNAb肌动蛋白终止子pLdhfrSV40启动子b肌动蛋白启动子抗体重链cDNAb肌动蛋白终止子pH瘤细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗体治疗非霍杰金淋巴细胞瘤患者，效果良好。重组抗体采用DHFR-MTX系统表达。第69页,共86页，2024年2月25日，星期天2.利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂第一个由重组哺乳动物dhfr启动子人tPAcDNA终止子细胞规模化生产的医用蛋白是治疗急性心肌梗塞的溶血栓药物：人组织纤溶酶原激活剂（tPA）。同样采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞选用CHO系统。目前，用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。信号肽编码序列此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。第70页,共86页，2024年2月25日，星期天t-PA的二级结构第71页,共86页，2024年2月25日，星期天第72页,共86页，2024年2月25日，星期天第73页,共86页，2024年2月25日，星期天第74页,共86页，2024年2月25日，星期天第75页,共86页，2024年2月25日，星期天第76页,共86页，2024年2月25日，星期天第77页,共86页，2024年2月25日，星期天第78页,共86页，2024年2月25日，星期天第79页,共86页，2024年2月25日，星期天第80页,共86页，2024年2月25日，星期天第81页,共86页，2024年2月25日，星期天3.利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIII生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。早在上述情况发生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA相似，人凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代血友病人的大量