检测猴艾滋病D型逆转录病毒抗体的ELISA技术.doc

检测猴艾滋病D型逆转录病毒抗体的ELISA技术 病毒 CHINESEJOURNALOFVIROLOoY 检测猴艾滋病D型逆转录病毒抗体的ELISA技术. 童臣立.晦志斌.田保平郑永唐 中国科学院昆明动物研究所昆明tf 撮要以超滤和蔗糖密度梯度超速离心法浓集和纯他猴艾滋病D型逆转录病毒SRV一1感染的 Raji细胞培养上清,制备出台sRV一1结构蛋白的抗原制荆.以台*/0.O2NaN.的碳酸盐缓冲浪 作为抗原包披液,不加任何封闭剂,待蒯血清以台有O.2NaN.和0.05NTweeta一20的PBS稀 释.以山羊或兔抗人IgG的辣根过氧化物酶结台物作为酶标抗体,成功地检测出猴血清中~SRVt~ 骱 …里坠5蚴关键词.苎苎堂塑猴.型逆转录病毒.星!垒抗体flt;I,,,5匕 八十年代初发现艾滋病后,在美国的一些灵长类研究中心发现了与人艾滋病的表现相似 的猴艾滋病(SimianAIDS,SAIDS)[1].在引起AIDS的逆转录病毒HIV被分离出来后不 久,引起sAIDs的病原体——猴艾滋病D型逆转录病毒(SimianAIDSTypeDRetro- virtls,SRV)[2]和来源于非洲的猴免疫缺陷病毒(SIV)[3]相继也被分离出来.SRV 是sAlDs的主要病原,它在美国几个灵长类研究中心的暴发流行曾造成大批猴死亡, 严重危害猴类的健康[4].近年来,人们对SRV感染的临床,病理,分子生物学,免疫学和 疫苗等各方面都进行了深入的研究,美国各灵长类研究中心和一些动物园还进行了血清流行 病学和病毒学普查,从中国进口的猴也分离到SRV(43.但是,除美国外,其他地方,包括 中国,尚无猴群SRV感染的正式报道.虽然SRV和HIV无论在遗传学上还是在血清学上都 投有密切的联系,但SRV的天然宿主是与人亲缘关系较近的猴,它可作为一种研究模型用 来研究逆转录病毒弓1起免疫缺陷和诱发肿瘤的机制.而且,生物学和实验医学的许多研究常 以猴类作为对象,某些疫苗的生产和病毒的培养也要采用来源于猴的细胞.为了保护猴群免 遭SAIDS的破坏,保证有关生物医学研究和生物制品生产的安全,需要采用简便而可靠的 方法查出SRV感染的动物,剔除传染源,选择无SRV感染的猴或细胞供实验所需.由于已 有的SRV一1～5型病毒的核心抗原P27和P14等在血清学上关系十分密切[5],所以可以用已知 的SRV抗原检测血清型未知的病毒的抗体.在SRV感染的血清学普查中,常用ELISA初 筛,再用Westernblot确证(B～0].因此,我们引进SRV毒株,制备病毒抗原,建立了检 测猴血清中SRV抗体的ELISA和Westernblot方法,并已实际应用于猴群监测工作中. 本研究得到云南省应用基础研究基盎以及云南夏长娄中心和昆明动物所长羹生物学旺台实验室基金资助. ¨现在工作单位卫生部成都生物制品研究所. 收稿日期t】991年5月14日,同年10月10日怔回. 期蜗 量1 第年 ~,卷吣80一第 ,, 薛 掌 诬 4期拴测猴芟滋病D型逆转录病毒抗体的ELISA技术355 材料和方法 (一)常毒和掘囊系SRV-I~4型病毒和Raj~.细胞由加里福尼亚夏长荑研究中,bMarx博士赠送 (=)箍血清取白本所饲养场猴.作为阳性对照的SRV-I实验感染猴恢复期血清由成都军区军事医 学研究所张新生先生赠进. (三)Raii细囊抗原的制备将Raji细胞按1000万个/m1悬浮于0.5MTris—HC1pH7.5缓冲液中 反复冻融5次,6000×g离心,收集上清,按Bradford法测蛋白浓度,调节至1mg/ml. (四)府毒抗原的镧备c7,93SRV-I感染的Raji细胞培养上清中的病毒用口一羟基丙酸内醑(1si— gmg)灭活后,经0.45~tm孔径的滤膜过滤,再将滤过液经MinltanSystem(Millipore)的聚砜膜 (截冒分子量为30万)超滤浓缩.将浓缩液100000×g4C离心2小时,将沉淀悬于TNE缓冲液中,再经 100000×g,4c,20～60蔗糖线性梯度离,C,3/b时.用自制的梯度收集器计滴收集,5滴为一组份,每管 可收集29组份.将各梯度组份超离心洗1次,沉淀悬于TNE(0.01MTrls,0.001MEDTA,0.14M NaCI)溶液中,调节各组份的蛋白浓度至1mg/ml.将各组份1:200稀释作为抗原包被干酶标扳上,以 Rajl细胞抗原为对照,将阳性对照(P),阴性对照(N)血清和3份未知样品猴血清(SI-S3)1:100稀 释干TNE-0.01BSA-0.05Tweeu-20中,用ELISA法测定密度梯度离心分离的各组份的抗原性质. (五)ELISA蔫定HRp-抗人lgG结合翩同猴IgG的交叉反应据报道,人和猴血清中IgG水平相当, 两者的抗原决定簇有相