最新南极冰藻GCL基因的克隆及GCL、GST基因的定量分析与原核表达.pdf

ICE—LGCL基因争K bp，歼放 5+非编码区36bp，3’1F编码匾711 2199bp，其。p 阅读框(ORF)1452 17 bp．编码483个氮基酸，其分子量值预测值(MW)为55 kDa，理论等电点(DI)为597。生物信息学分析混示：ICE—LGCL基因编码的蛋白 N术端无信弓肽；下存在跨膜区及N．糖基化位点：定位分析ICE·LGCL最可能来源 于南极冰藻线粒体：氨基酸序列同源性对比发现ICE-LGCL基因与菜茵衣藻 reinhardtii)、水稻(Oryza (Chlamydomonas thaliana)及莲桤 elegans)、拟南芥(Arabidopsis bungeana)、百R菊(Zimffa (Loats (XM001701595)同源性最高，一致性达6998％。 荧光定量PCR结果显示，GCL、GST在不同胁迫条件后均能表达，且对照组的 h表逃量缓慢 表达量均基本维持在同一水平。对于温度．GCL基因在0℃时，前24 05)：在 增加，第24h的表达量达到虽大，约诈常水平的两倍显著高于对照(P0 处理24—72h期问表达量逐渐下降．第72h饿复至正常水平以下：14℃时，GCL的 表达繁只有第6h时略低于对照组．其他取样点的表达量均约只有对照组的一半： h时达到最_人．约对照组的两 GST鉴因在0℃时，前12h的表达量逐渐增大且在12 h的表 倍显著商r正常水平(P005)，后逐渐恢复到对照组水平：14℃时，前12 达龟略低于刘照纽，在24h后表达量恢复至正常水平并丌始增加，36h达到最大， 约对照组的两倍多．显著高]二正常水平(P005)，后逐渐减少至正常水平。对于 盐度(对照组为33‰)，奠中低浓度盐度对GCL基因的表达有一定的促进作j{j． 浓度为11时．前12h的表达量略低于f常水平，24h后的发达量恢复至正常水平并 逐渐J二升且在48h达到最大约对照组的两倍(P005)．后又降至一常水平之下； 浓度为22时，GCL的表达量均高于正常水平，48h时的表达量达到蹑大．其中 48、72 h的表达母均显著高于正常水平(P0 的表达，且浓度商时抑制作川硝强。 同时，我们对ICE—LGCL和ICE—LGST进行了原核表达、Westemblot分析，其原 蛋白的诱导表达。分别优化了重组质粒在BL21中最佳表达的温度、IPTG浓度及诱 mmol121 导时nU，最终确定pET—GCL重组质粒的最佳诱导表达条件为：37℃．0．6 IPTG，诱94 2mmolL‘IPTG， h：pET—GST重组质粒的最佳诱导条件为：37℃，0 诉导4h。SDS．PAGE结果显示两个重组质粒表达的蛋白均主要以包涵体为主。 Westem blot结果分别证明所表达的蛋白为卜谷氨酰半胱氨酸连接酶蛋白、谷胱甘肚 硫转移酶蛋白。另外对含有重组质粒pET—GST的大肠杆菌BL2l进行了低温耐受性分 析．结果显示GST基因在大肠杆菌中的表达在一定时间内可以增强大肠杆菌BL21对 低温的耐受性。 关键词：南极冰藻ICE-L，Y-谷氢酰半胱氨酸连接酶，谷胱甘肚硫转穆酶，克隆。定 量PCR．