相对定量分析.ppt

Types of Quantification Real-time PCR quantification approaches are divided into two main groups: Absolute Quantification for determination of absolute concentration values e.g., virus load/ml blood Relative Quantification for determination of gene expression * 高级相对定量分析Target Name 选中目的基因的名字然后点击Show Abs Quant 查看并调整相关基因的扩增结果 Crossing Points Results Replicate Statistics Display Efficiency … * 高级相对定量分析Results - Sample View * 高级相对定量分析Result - Settings * LightCycler? 480 Software 1.5 Report * 相对定两分析模块Basic and Advanced: Analysis Options ? Basic Advanced multiple target and reference genes? Y Y T/R pairing rules All to Mean all 4 calibrator allowed? Y Y T and R genes on different plate? N Y subset allowed? N Y Cp analysis methods Fit point Fit point and 2nd Der. Max standard curve samples allowed? Y Y efficiency correction? Y Y multiplex possible? Y Y * 相对定量的原理 相对定量实验的分析方法 相对定量实验设计 总结 * 相对定量 实验设计- 主要因素 1. 实验设计 确定研究的目的基因 选定合适的内参基因（最好能多选取几个） 优化反应条件 选择合适的样本及样本制备方法 (包括对照样本的选取) 2. 实验验证 确定实验的效果 (动态范围 效率) 3. 分析方法的选择 简单相对定量分析 高级相对定量分析 * 一步法 or 二步法 RT-PCR One-Step RT-PCR: 逆转录PCR扩增过程一次完成 操作简单 污染几率低 快速 引物的特异性要求高 Two-Step RT-PCR: 逆转录和PCR扩增分别完成 不同的引物选择(oligo dT, random hexamers, specific) cDNA 便于长期保存 * 目的基因内参基因扩增方式的设计 目的基因和内参基因分别在不同的反应管中扩增? 表达水平差异很大 目的基因和内参基因通过不同的run扩增? PCR反应程序不同? 不同的检测模式 (e.g. SYBR Green I) and reference (e.g. HybProbe format) 目的基因和内参基因进行多重PCR扩增 (dual color) ? 多重荧光扩增会降低动力学范围? 比较单色扩增和双色扩增时目的基因与内参基因的动力学范围 * Calibrator Normalized Relative Quantification 设置 无扩增效率校正(E = 2): 简单方法 有扩增效率校正: 高级相对定量 ? 双标法 效率 影响因子 Determination of a correction factor and/or a multiplication factor 单色 (目的基因和内参基因在不同的反应管或反应孔) 双色 (目的基因和内参基因在同一个的反应管或反应孔) flexible ?Pairing“ of target and reference samples (multiple housekeeping genes) 反应的设置 校准样本 选择合适的校准样本 * LightCycler? 相对定量分析Workflow Established LightCycler? PCR for target and reference gene Determination of a calibrator LC run with samples and calibrator (target/reference) Analysis Basic Advanced * 相对定量