饲料中β-胡萝卜素的测定 高效液相色谱法.docx
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DB33/T2333—2021
饲料中β-胡萝卜素的测定高效液相色谱法
1范围
本标准规定了饲料中β-胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料中β-胡萝卜素的测定。
本标准配合饲料、浓缩饲料、精料补充料的定量限为1mg/kg，添加剂预混合饲料定量限为2mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法
GB/T20195动物饲料试样的制备
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中β-胡萝卜素经碱溶液超声皂化，生成全反式β-胡萝卜素，经石油醚萃取，减压浓缩后，用高效液相色谱法测定，外标法定量。
5试剂或材料
5.1除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
5.2水：GB/T6682-2008，一级。
5.3甲醇：色谱纯。
5.4异丙醇：色谱纯。
5.5二氯甲烷：色谱纯。
5.6石油醚（沸程30℃~60℃)。
5.7正己烷
5.8无水硫酸钠。
5.9乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。
5.102,6-二叔丁基对甲酚（BHT）。
5.11L-抗坏血酸乙醇溶液：称取L-抗坏血酸0.5g，加4mL水加热溶解，用无水乙醇稀释至100mL混匀（现配现用）。
5.1250%氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾50g，加水100mL溶解，混匀。
5.13饱和氯化钠溶液：先将烧杯中的水煮沸，向沸水中边搅拌边加入氯化钠，直到有固体颗粒析出，将此溶液冷却至室温。
5.14标准储备溶液（500μg/mL）：称取全反式β-胡萝卜素标准品（CAS：7235-40-7，纯度不低于95%）50mg（精确至0.01mg）至100mL棕色容量瓶中，加入10mL二氯甲烷（5.4）溶解，用二氯甲烷（5.4）稀释并定容至刻度，混匀，每次临用前按附录A标定。-20℃保存，有效期2个月。
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5.15标准中间溶液（100μg/mL）：精确移取β-胡萝卜素标准储备溶液（5.13）10.0mL于50mL棕色容量瓶中，加入二氯甲烷（5.4）稀释并定容。于4℃保存，有效期为1周。
5.16标准系列溶液：精确移取适量β-胡萝卜素标准中间溶液（5.14）于100mL棕色容量瓶中，用流动相稀释定容配成系列标准溶液，浓度分别为0.0μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL。临用现配。
5.17微孔滤膜：0.45μm，有机系。6仪器设备
6.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器/二极管阵列检测器。
6.2分析天平：感量分别为0.001g和0.01mg。
6.2超声波清洗器。
6.3旋转蒸发仪。
6.4旋涡仪。
6.5分光光度计。
7样品
按GB/T20195制备试样，至少200g，粉碎使其全部通过0.42mm孔径的分析筛，充分混匀，装入磨口瓶中，避光保存，备用。
8试验步骤
警示——应避光操作！
8.1皂化
平行做两份试验。称取试样配合饲料、精料补充料、浓缩饲料2g～5g或添加剂预混合饲料0.2g~1g，精确至0.001g，置于250mL具塞棕色三角瓶，加入EDTA（5.8）1g，边摇边加入L-抗坏血酸乙醇溶液（5.10）50mL使试样完全分散、浸湿，加入10mL50%氢氧化钾溶液（5.11），混匀，50℃水浴加热超声皂化20min，不时振荡防止试样粘附在瓶底和瓶壁上，皂化结束后取出迅速冷却至室温。
8.2提取
将皂化液转移至盛有80mL石油醚（5.5）的500mL分液漏斗中，用30mL～50mL水分2次～3次冲洗棕色三角瓶并入分液漏斗，旋紧瓶塞，轻轻振荡，放气，静置分层。转移水相至另一分液漏斗中，加入60mL石油醚（5.5）重复提取两次，弃去水相，合并三次石油醚相。用100mL饱和氯化钠溶液（5.12）洗涤石油醚提取液一次，轻轻旋摇防止乳化，弃去水相；再用水洗涤石油醚提取液至中性。石油醚提取液过无水硫酸钠（5.7）过滤脱水，转移至放有几粒BHT（5.9）的250mL棕色容量瓶中，用石油醚（5.5）定容，摇匀。
8.3浓缩
从石油醚提取液（8.2