大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施.doc

　　大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施 作者：何俊，徐文莉，曾思，曾因明，庞庆丰 【摘要】 目的 改良原代肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage, AM)培养技术，提高AM培养效果。方法 SD大鼠，在体支气管灌洗肺获取AM，通过预先注射空气、14号注射器针头回收灌洗液、低速离心、种板前多次吹打等改良措施分离和培养AM。倒置显微镜连续观察AM的形态变化，台盼蓝拒染实验鉴定AM存活率，瑞氏-姬姆萨染色鉴定AM纯度。结果 AM体外培养后40 min即见细胞贴壁;2～3天时，细胞形态多样，呈圆形、不规则形、梭形等形态，胞体变大，胞质丰富。台盼蓝拒染实验示AM存活率≥95%，瑞氏-姬姆萨染色示AM纯度≥95%。结论 本实验改良了原代AM培养的技术方法，提高了原代AM培养效果。 【关键词】 肺泡巨噬细胞;细胞培养;技术改良 　　Abstract: Objective To modify the techniques for primary culture of highly purified the primary rat alveolar macrophages (AMs). Methods AMs odified techniques as pre-injection of air and reclamation of brochoalveolar lavage fluid ulti-bloorphological changes icroscope. The cell survival rate ined by s adhered to plastic surface in; 2-3 days later, cell morphology presented mixed shapes, i.e., circular, irregular and spindle shapes. The trypan blue test shosa staining indicated a purity ≥95% of the AMs. Conclusion The modified techniques employed in our experiment had better results for the isolation and primary culture of AMs. 　　Key acrophage; cell culture; technique modification 　　肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)分布于呼吸道-肺泡表面，是肺部抗感染的第一道防线, 是肺部抵抗病原感染的重要组成部分。AM不仅具有吞噬和抗原递呈功能，而且还能分泌多种生物活性物质,对急性肺损伤的发生、 发展 及转归具有重要影响[1-3]，因此，AM一直是研究肺部抗感染模型的重要细胞类型。但由于在分离培养原代AM过程中存在获取率低、混杂红细胞、容易污染损伤、不易贴壁等技术难题[4]，目前国内外研究者只能使用小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S[5]、大鼠肺泡巨噬细胞株 NR8383[6]等细胞株替代原代AM，然而AM细胞株与原代培养的AM在细胞形态、细胞活力及细胞生理等方面存在明显差异。因此，优化原代AM培养技术从而得到理想的AM对研究肺部感染性疾病发生机制有很重要的作用。本研究探讨AM培养技术的改良措施及注意事项。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。 　　1.1.2 主要试剂和器材 DMEM(低糖)培养基( Gibco公司 )，胎牛血清(杭州四季青有限公司 )，青霉素、链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)，PBS(北京中杉金桥生物技术有限公司)，台盼蓝染液(Sigma公司)，瑞氏-姬姆萨染液(南京建成科技有限公司)，细胞培养箱(美国 Thermo Fisher Scientific )，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置显微镜(日本Motic公司)，离心机(美国 Beckman公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 AM的分离培养 在 参考 郭晓芳等[7-8]分离AM技术的基础上，我们对分离AM的方法加以改良。SD大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，引颈处死;在75%乙醇中浸泡消毒1～2 min，移到超净工作台上，仰卧于小手术台上，固定头尾;打开胸腔，暴露肺;暴露颈部气管，用14号注射器针头从颈部正中线切口行气管插管，用4-0的手术缝合线结扎固定[8-9]。用冷PBS在体气管灌洗肺，同时按摩肺，每次5～10 ml，灌洗10次，灌洗液回收率为90%。灌洗液经200目细胞筛过滤，1 000 r/min低