大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代.doc

大鼠大脑皮层细胞原代培养 南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01 一、试剂 Poly-L-lysineDMEM（Invitrogen,11995-065） FBS（Invitroge,10099-141） HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112） 0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）HyClone，SH30028.01B） dd H2O 75％酒精 二、器械 手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x1 100 ml小烧杯 200目不锈钢筛 细胞计数器（求精） 50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790） 25ml培养瓶（Corning）或75ml培养瓶（Corning） 100ml玻璃瓶（蜀牛） 直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010） 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1） 过滤器（Millex-GP, SLGP033RB） 注射器：50ml、5ml各 1 Pipette and pipette tips 冰袋、手套、口罩 Day 1 1、消毒 1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。 1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。 2、包被培养板 2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。 2.2 μg/ml。 2.3 以包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。25ml培养瓶：3ml；75ml培养瓶：8ml。 3、配置培养基、消化酶 3.1 DMEM with 10% FBS FBS：DMEM=1：10 取FBS 8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。 3.2 0.125％胰酶 取0.25％Trypsin-EDTA,用稀释将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。 4、消毒 操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。 Day 2 1、消毒 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。 3、解剖新生鼠（所有操作在冰袋上进行） 3.1 将24小时之内的新生鼠在100ml烧杯中用75%酒精浸泡min。 3.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。 3.3 取2个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。 3.4 剪去新生鼠的头，将头放入一个培养皿中。 3.5 用剪把新生鼠头骨剪开，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有的新生鼠都同样处理）。 3.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。 3.7 将分离好的脑膜用剪剪碎脑组织，约1mm3。 4、接种细胞 4.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。 4.2 每支离心管加入3 ml 0.125％胰酶，摇匀，37℃消化15分钟（为增加接触面积消化更充分可将离心管平放，也可以用60 mm培养皿消化。） 4.3 消化期间整理操作台。 4.4 消化15min后，用移液管除去胰酶，每支离心管加入2 ml 10％ FBS/DMEM终止消化。 4.5 吹打：3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢4.6 过筛网至60 mm培养皿中。 4.7 将培养皿中液体移入2支15 ml离心管中。 4.8 离心：00g/min,5min。 4.9 弃上清，沉淀的细胞加10％FBS/DMEM 3ml重悬，轻柔吹打次（具体吹打次数据细胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。 4.10 用细胞计数板计数：细胞浓度 = (4个大格细胞总数/4) × 104 /ml 4.11 调浓度，接种。接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。要左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度）。 具体细胞接种数值： 培养液体积（ml/瓶） 细胞密度（个/ml） 总细胞数（个/瓶） 25cm2培养瓶 4ml 1x106 4x106 75 cm2培养瓶 15ml 1x106 6-8x106 5、消毒 实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。 6、换液 细胞种植成功后24小时全量换液，以后每天观察细胞生长状态，每 3天半量换液。注意