流式细胞仪的原理与应用.ppt

****************************************************************************（5）FCM分选指标：分选指标主要包括：分选速度、分选纯度和分选收获率。分选速度指FCM每秒从液体中提取所要细胞的个数。目前台式FCM带分选功能的只有BD的FACSCalibur，其分选速度为300个/秒。BD的大型机分选速度可达几万/秒。分选纯度指被分选出细胞中目标细胞所占的百分率。BD的FCM的分选纯度均可达99%。分选收获率指被分选出细胞占原来溶液中该细胞的百分率。通常情况下，分选纯度和收获率是矛盾的，纯度提高，收获率下降，反之依然。这是由于样品中细胞不是一个接一个等距离排列，而是随机的。因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同条件下，仪器会作出取或舍的决定，因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。******这是FACSCalibur流式细胞仪的光路图，这里先说一下我们所就是这个机型，它是双激光四色分析系统，也就是说这台机子配备了两根不同的激光作为激发光源从而实现4个荧光参数的分析，FL1-4,通常指的是FITC,PE,PerCP,APC四色荧光。下面看一下光路图，这是488nm的蓝色激光，然后还有一个是635nm的红色激光，经过聚焦透镜聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，也就是图上的flowcell,被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。我们看一下，前向角光散射信号在前向小角度进行检测，?这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号和侧向角光散射信号的接受方向与激光束垂直，我们看一下，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，得到ssc和多个不同波长的荧光信号。?**我简单给大家介绍一下激光(Laser)，荧光素与荧光，FACS检测的信号参数**激光，是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，他的单色性好，方向性好，亮度高，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为１微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。目前流式细胞仪上配的比较多是激光波长是488nm,635nm****流式上经常使用的********************这是用CD3-FITC和CD19-PE对外周血进行双色直接染色后行流式细胞仪分析后得到的散点图。从这个散点图上我们也可以看到我们检测的一大群细胞里主要有三小群细胞，看图上，通常我们把左下脚的认为是双阴性的细胞群，双阴性细胞群的位置在流式细胞仪里我们是通过设十字门来确定的，而十字门的位置则是通过同型抗体确定的。十字门的位置一确定，我们就可以把双阴性、双阳性和单阳性的细胞群的位置确定了。在图上，我们可以看到**以上我们讲了流式细胞仪可检测到的各种细胞参数

********目前公认的最佳图像处理系统,使流式细胞仪的功能发挥更加完美。************流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

****FC500该机型优点：单激光可进行5色检测文件均可转换成WORD或PDF文档，便于应用***?当二倍体细胞被化学定量式DNA染料着色后并在流式细胞仪上分析，会观察到一个很“窄”荧光峰。它将出现在以荧光强度为X轴、细胞数量为Y轴的坐标上。因为G1期细胞具有相同的DNA含量，理论上G1期细胞的DNA含量荧光强度应当一致，并在直方图上的一个通道上出现信号（在直方图上出现一条G1期细胞的荧光直线）。如果流式细胞仪十分完美且DNA染料的特异性绝对专一，这种情况将会发生。而在实际中，流式细胞仪本身存在着许多变异性，此外DNA染料的着色也存在生物学的变异。因此，检测得出的G1期细胞的荧光分布正常的是呈高斯曲线分布。这种“钟”型分布与检测的变异相关。检测中的变异越大，高斯曲线的宽度越宽。有一个名为“变异系数”（CV）的指标用于描述峰的宽度。第128页，共1