流式细胞术原理及应用新.pptx

流式细胞术原理及应用新;流式细胞术的原理及其应用 ;第3页/共81页;FLOW CYTOMETRY 流式细胞术 FLOW CYTOMETOR 流式细胞仪;Flow Cytometry Measuring properties of cells in flow Flow Sorting Sorting (separating) cells based on properties measured in flow Also called Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS);分为三大类： 第一类－－台式机 光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合 用于临床 第二类－－大型机 科研型，分辨率高，可分选用于培养，可选配多种激光器，更灵活 第三类－－新型流式细胞仪 装配有2～4根激光管，同时检测15个参数，高速分选达50000个/s;第7页/共81页;第8页/共81页;第9页/共81页;;流式细胞仪的主要组成部分：; 流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 目前，该技术以广泛用于生物及医学基础研究与临床检测，在分子生物学、免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领域内发挥着重要作用。 ;;鞘液系统;;光路系统;;;;;;光学原理;;第24页/共81页;;抗体标记的方法;抗体的选择;数据处理系统;流式细胞分析的信息;;流式细胞的主要信息:Fluorescence;Gating;流式常见图形 (Histogram Plot);流式常见图形 (Dot Plot);流式应用常见范围;实验对照的设计;实验标本的处理;;;SORTING（细胞分选）;;流式细胞术的应用;细胞凋亡与坏死的区别　　虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。　　坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的炎症反应。　　凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。 ;细胞凋亡的生物学意义;凋亡检测每一步都有检测试剂盒;1、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期） 2、Annexin V-FITC/PI 法（早期） 3、Apo2.7检测法（早期） 4、TUNEL 法（晚期） 5、DNA含量分析法（晚晚期） 6、细胞凋亡相关基因的流式细胞术检测; 亚二倍体峰（凋亡峰） --- PI staining不能区分凋亡与死亡细胞;Annexin V Assay建议用于悬浮细胞;Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡;;细胞周期;（二）定量流式细胞术 （quantitative flow cytomety) 通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，通过标准曲线求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反映在某种生理病理条件下出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意义。;微球流式芯片技术CBA(Cytometric Bead Array);（三）流式细胞术的临床应用;流式细胞术与造血干细胞移植;流式细胞术与白血病免疫分型;流式细胞的免疫分型：;微小残留病变的检出（MRD）： MRD是白血病复发的主要根源，FCM的高特异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，早期探测MRD，以免复发。 ; 有证据表明外周血淋巴细胞HLA-B27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大相关性，利用流式细胞术进行HLA-B27检测，可同时排除交叉反应，是目前检测HLA-B27的最好方法。;第60页/共81页; 淋巴细胞亚群分析 机体免疫状态是衡量机体是否罹患疾病的重要指标，目前多采用流式细胞术来检测机体的免疫状态，其中最重要的指标是检测T,B,NK淋巴细胞的水平。;常用细胞表型及意义 （cluster of differentiation,CD) CD3 总T细胞 CD4 T辅助/诱