流式细胞术原理及应用.ppt

什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠为什么要进行补偿调节？520400500600700575665FITCPEPC5laserD、单标对照SingleStainingControl第31页，共57页，星期日，2025年，2月5日第32页，共57页，星期日，2025年，2月5日补偿调节方法：FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2BeforeCompensationAfterCompensationFITC单标PE单标第33页，共57页，星期日，2025年，2月5日什么样的补偿最合适？单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时为最合适的补偿。UncompensatedCompensatedFL1-FITCstainFL2-nostainFL1-FITCstainPE-MediannegPE-MedianposPE-Medianneg=PE-MedianposPE-MediannegPE-MedianposFL1-FITCstainOvercompensated第34页，共57页，星期日，2025年，2月5日准确补偿的重要性第35页，共57页，星期日，2025年，2月5日补偿调节要合适未补偿正确补偿FITC-PE补偿太大PE-FITC补偿太大第36页，共57页，星期日，2025年，2月5日使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别染色n色分析就要制备n个补偿对照管举例：双染实验第37页，共57页，星期日，2025年，2月5日设门与数据分析门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。第38页，共57页，星期日，2025年，2月5日流式结果十字门线性门第39页，共57页，星期日，2025年，2月5日黏附因子表面受体细胞因子分泌到胞外的细胞因子胞内抗原核酸含量核内抗原细胞功能细胞表面、胞浆、核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性细胞受体细胞内钙离子流式细胞仪检测范围第40页，共57页，星期日，2025年，2月5日第1页，共57页，星期日，2025年，2月5日一、流式细胞术基本概念流式细胞术（FlowCytometry）是对于处在快速直线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选技术.研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等。对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量分析。第2页，共57页，星期日，2025年，2月5日第3页，共57页，星期日，2025年，2月5日流式细胞仪构造图第4页，共57页，星期日，2025年，2月5日流式细胞仪五大系统流动室与液流驱动系统激光光源及光束成形系统光学系统信号检测与分析系统细胞分选系统第5页，共57页，星期日，2025年，2月5日流动室与液流驱动系统InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流动室，430×180um,鞘液1.空气加压进样2.蠕动泵精确定量进样第6页，共57页，星期日，2025年，2月5日激光光源与光束成形系统1.氩离子气体激光器，22×66um2.固体激光器405nm,488nm,561nm,635nm第7页，共57页，星期日，2025年，2月5日光学系统透镜、滤光片、小孔；LP：long-passfilterSP：short-passfilterBP：band-passfilter460500540SP500LP500BP500/50第8页，共57页，星期日，2025年，2月5日信号检测与分析系统物理参数FSC：前向角散色光，代表细胞大小SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度第9页，共57页，星期日，2025年，2月5日粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。第10页，共57页，星期日，2025年，2月5日阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时