流式细胞术的原理及应用.ppt

流式细胞术的原理及应用

;

流式细胞术〔FlowCytometry,FC/MFACS〕是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒〔通常是细胞〕的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选

研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等

研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量;流式细胞仪特点;FACSCalibur;BDLSR;FACSVantageDiVa;FACSAria;流式细胞仪检测范围;流式细胞术开展简史;流式细胞仪的工作原理;FCM的工作系统;2.光学系统：

激光是较常用的光源,稳定性好、单色性好。

散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。

3.数据处理系统：

对实验数据分析、存储、显示。

具有智能化、自动化特点。

;流式细胞仪仪器结构;;液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱;光学系统;入射光—激光光源;18;发射光;散射光;ForwardAngleLightScatter;90DegreeLightScatter;Laser;LongpassShortpassBandpass;电子系统：光电倍增管（PMT）;;细胞分选系统;当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干预检测器(interferencedetector)，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescencedetector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。;FluorescenceActivatedCellSorting;信号检测--荧光信号;31;32;33;34;光路——荧光信号;荧光信号;37;38;39;40;流式细胞仪的电子系统;数据处理;流式细胞仪数据分析〔1〕;流式细胞仪数据分析〔2〕;流式细胞仪数据分析〔3〕;;流式细胞仪的应用;临床研究;根底研究;50;抗体的选择;光谱交叉;荧光补偿方法;流式细胞术样品制备的要求;实验对照的设计;实验标本的处理;特别提醒注意;同型对照：为阴性对照；实验中选用的大鼠或小鼠源性标记单抗，就一定选用相同源性的标记单抗作为同型对照来调整设置电流电压。

上机前一般需过目：200-300目

全程质控：从样品制备和标记、溶血、洗涤、仪器质控和上机检测，需全程质控。;样品

???养细胞

新鲜组织

石蜡包埋;细胞周期分析

〔DNA 倍体分析〕;细胞周期、DNA倍体分析原理;样品制备;建立获取模式，获取数据

〔PI单染分析细胞周期，同时看凋亡〕;G0-G1;数据分析

;细胞凋亡分析;凋亡细胞的特点;FCM在细胞凋亡检测中的应用;DNA含量分析

凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的DNA含量相对减少，因此在DNA的直方图上出现一个位于G1峰左侧的小峰〔亚G1峰〕，称为AP峰。

FCM的DNA分析检测细胞凋亡存在一定的局限性。比方，机械处理的肿瘤标本常有许多碎片，在DNA直方图上出现较宽的杂信号峰，使凋亡细胞被“淹没”其中，不少文献将G1峰前的所有信号均算为凋亡细胞，可能会过高计算凋亡细胞的数量；因此在评价细胞早期凋亡时，该指标不够灵敏。;70;AnnexinⅤ磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜外表磷脂酰丝氨酸

细胞凋亡早期，细胞外表发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸〔PS〕可以迁移到细胞外层外表。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞外表的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体防止因细胞内部暴露引起的炎症反响。AnnexinⅤ是一种Ca离子依赖的、对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有PS而识别凋亡细胞，由于坏死细胞也可能在膜外表出现PS，故需要同时进行染料〔PI〕排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。;

AnnexinV/PI双染

活细胞为〔AnnexinV-/PI-〕

坏死细胞为〔AnnexinV+/PI+〕

凋亡细胞〔AnnexinV+/PI-〕;细胞周期

不能区分凋亡与死亡细胞

Sub-G0/G1peaks---PIstaining;74;AnnexinVAssay

建议用于悬浮细胞;AnnexinVAssay

能够区分死亡与凋亡;AnnexinV-PE/7-AAD双染色法;T

U

N

E

L

检

测;注意：;人外周血淋巴细胞亚