茶树生物技术-基因工程载体.ppt

③lacZ的?肽互补1）?-肽（lacZ’）：?-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。?-半乳糖苷酶只有在4聚体的状态下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚体2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15）受体菌基因组的?-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失?肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解X-gal受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC质粒载体上的lacZ’编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，可以分解X-gal，产生蓝色物质。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受体菌lacZ?3）载体lacZ’与?互补4）?肽互补的插入失活pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止?肽的合成。lacZ’5’3’?肽移码突变lacZ’5’3’?肽不互补互补MCS外源DNA④IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’?肽都表达。从而互补。IPTGIPTG,异丙基-?-D-硫代半乳糖苷通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，MCS有插入时，IPTG诱导的结果：?无质粒的受体菌?-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；无抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养无菌斑生长无外源DNA插入质粒转化的受体菌?-半乳糖苷酶的缺失被载体产物?肽互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有蓝色菌斑生长有外源DNA插入的质粒转化的受体菌载体产物失活，不能互补?-半乳糖苷酶的缺失，不能分解Xgal。但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有白色菌斑生长（5）pUC系列载体的优点①更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。②选择方便X-gal显色、抗菌素双重直接选择。③克隆便利具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④测序方便5、其它质粒载体（1）pGEM-3Z由pUC派生而来。与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。T7启动子SP6启动子MCSlacZ’Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。①如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA②外源基因正接反接都可以转录。③MCS与pUC18的完全一样。（2）pGEM-4Z：与pGEM-3Z相同，只是T7启动子和SP6启动子的位置互换。pGEM-3Z的特点：（3）穿梭质粒载体1）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。（shuttleplasmidvectors）Yeast复制起点E.coli复制起点E.coli选择标记Yeast选择标记MCS大肠杆菌?枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌?酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌?动物细胞穿梭载体2）常用的穿梭质粒载体氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）4.质粒的选择标记及原理①抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：（1）选择标记②遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（2）抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素5.人工构建的质粒载体的类型高拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体复制失控的质粒载体插入失活型质粒载体正选择的质粒载体表达型质粒载体（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体但有特殊用途:由pSC101派生来的载体特点是分子量