生物技术基因工程篇.ppt

*******从宿主菌体中释放出来的M13噬菌体粒子只含单链DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中两条中的一条，因此可用来制备单链DNA探针，也可以用作DNA测序的模板。筛选：蓝白筛选第32页,共62页，2024年2月25日，星期天

是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。

由入噬菌体的cos区与质粒重组建造而成。

在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。（3）粘尾质粒(cosmid)/粘性质粒/粘粒/cos质粒第33页,共62页，2024年2月25日，星期天cosmid的构造特点:

含有抗药标志和复制起始部位；

一个或多个单一酶的限制位点；

带有入噬菌体粘性末端；

分子小，可容纳大的外源DNA片段。第34页,共62页，2024年2月25日，星期天将染色体端粒序列（TEL）、自主复制序列（ARS）、着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP）基因和多克隆位点（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，转化酵母细胞YAC。（1）酵母为宿主的载体3、真核细胞为宿主的克隆载体人工构建的酵母质粒酵母人工微小染色体（YAC）第35页,共62页，2024年2月25日，星期天第36页,共62页，2024年2月25日，星期天（2）以植物细胞为宿主的基因克隆载体Ti质粒第37页,共62页，2024年2月25日，星期天（3）DNA病毒载体1）SV40载体（猴肾病毒）完整的SV40载体利用SV40元件组建的穿梭质粒载体，如pSVK3质粒：由噬菌体三种载体构建而成质粒SV402）乳头瘤病毒载体如pBPV载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。3）腺病毒载体如pBPV载体是在牛乳头瘤病毒基础上构建的穿梭载体。第38页,共62页，2024年2月25日，星期天克隆载体(cloningvector)用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。表达载体(expressionvector)在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。第39页,共62页，2024年2月25日，星期天启动子、核糖体结合位点、克隆位点、转录终止信号大肠杆菌表达载体除克隆载体的特性外还含有：哺乳动物表达载体除含有原核序列（在E-Coli中的复制起始点、便于筛选的抗性基因）还包括：启动子/增强子、克隆位点、终止信号和加poly（A）信号。第40页,共62页，2024年2月25日，星期天三、目标基因与载体DNA连接形成重组体

工具酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)

能识别DNA分子内部的特异的对称序列,水解磷酸酯键，切断分子。

识别序列的特点①专一；②常由4~6个碱基组成；③具有回文序列BamH1酶-GGATCC-

-CCTAGG-第41页,共62页，2024年2月25日，星期天

限制性内切酶都是从原核生物中发现的。到目前为止已发现上千种限制性内切酶，其中数十种被经常使用。

水解磷酸二酯键，产生DNA片段的5′端为P，3′端为—OH第42页,共62页，2024年2月25日，星期天第43页,共62页，2024年2月25日，星期天限制酶的命名EcoRⅠ细菌的属名从该细菌中分离出的第几个酶细菌种名细菌株系第44页,共62页，2024年2月25日，星期天切口类型：

（1）形成粘末端(cohesiveend)：第45页,共62页，2024年2月25日，星期天目的基因第46页,共62页，2024年2月25日，星期天第47页,共62页，2024年2月25日，星期天连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。第48页,共62页，2024年2月25日，星期天（2）形成平末端SmaⅠCCC↓GGG

GGG↑CCC第49页,共62页，2024年2月25日，星期天DNA连接酶(DNAligase)第50页,共62页，2024年2月25日，星期天四