农推-林业生物技术-基因工程.doc

第二章 林木基因工程 本章要点 2.1 基因工程的基本知识 2.2 植物基因的分离克隆 2.3 植物遗传转化 2.4 基因工程与林木遗传改良 2.1 基因工程的基本知识 基因工程 遗传工程，重组DNA技术(DNA recombination) 是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导入受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。 可以跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因导入到新的生物中，实现不同生物的基因重组或基因转移，达到对某种生物个别性状遗传改良的目的。 是现代生物技术的核心和支柱。 基因组 某种生物体或一个细胞所携带的全部DNA序列的总和。 狭义的基因组（genome）是专指核基因组。 广义的基因组还包括叶绿体基因组和线粒体基因组。 核基因组 是指维持生物体完整生命功能所必须的1组染色体或配子体（性细胞）所包含的全部DNA序列（nDNA）。 一个生物物种单倍体基因组的DNA含量称为该物种的C值，每一个生物物种的C值是恒定的，一般用pg或碱基对表示。1pg=10-12g，相当于31cm长的DNA排列，约109bp。 叶绿体基因组 叶绿体是植物进行光合作用的场所， 叶绿体中含有独立于核基因组以外的叶绿体基因组，称为cpDNA。 一个植物叶片细胞通常含有数百个叶绿体， 一个叶绿体中含20-80个cpDNA拷贝。 银杏的叶绿体基因组为158kb。 线粒体基因组 线粒体是动植物细胞将有机物质氧化降解成水和二氧化碳、并释放出能量的细胞器。 也含有独立于核基因组以外的基因组，称为线粒体基因组，其DNA称为线粒体基因组DNA（mtDNA）。 植物的线粒体基因组比动物要大得多。 植物线粒体基因组含有数目不等的内含子序列。 基因 指编码功能蛋白质或RNA分子所必须的DNA序列或RNA序列，是遗传的功能单位，可产生或影响某种表型。 一般又可分为 结构基因 (structure gene)：编码蛋白质（或RNA） 调控基因 (control gene)：调控结构基因的表达。 通常指结构基因。 真核基因的结构 2.2 目的基因的克隆 2.2.1 基因克隆的工具酶 2.2.2 基因克隆的载体 2.2.3 基因克隆的方法 2.2.1基因克隆的工具酶 限制性内切核酸酶 restriction endonuclease DNA连接酶 DNA ligase DNA聚合酶 DNA polymerase 反转录酶 碱性磷酸酶 S1核酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶 2.2.1.1 限制性内切核酸酶 限制作用：一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA（如噬菌体DNA），使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。 修饰作用：生物细胞自身的DNA分子通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置发生了甲基化，而得到修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。 2.2.1.1 限制性内切核酸酶 主要有 I 型、Ⅱ型、Ⅲ型。 Ⅱ型运用最广泛，I型和Ⅲ型应用极少。 I型目前发现的只有EcoB和EcoK两种， Ⅲ型目前已知的主要是EcoPI和EcoP15。 (1)Ⅱ型限制性内切核酸酶的特点 ①能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位点通常具有双链回文对称的结构； ②切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补，并能够重新连接； ③切割和修饰功能由两种不同的酶催化完成； ④切割不需要ATP和SAM（硫腺苷甲硫苷酸）作为活性催化因子。 （2）命名和分类 ①利用属名的第1个字母和种名的前2个字母代表内切酶的来源。例如，来自大肠杆菌(Escherichia coli)的内切酶用Eco来命名，来自流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）的用Hin表示。 ②第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。例如，EcoRI中的R表示该酶来自大肠杆菌的R菌株。 ③在同一菌株分离获得的不同内切酶按照分离时间的先后，以罗马数字加以标注，如HindI、HindⅡ、HindⅢ。 （3）影响因素 ①DNA的浓度和质量----最关键的因素。 ②酶切消化的缓冲液。 ③酶切反应的温度。 ④其它因素。 （4）应用 ①构建重组的DNA分子。 ②探针准备。 ③DNA物理图谱构建。 ④DNA甲基化分析。 2.2.1.2 DNA聚合酶 作用： 将脱氧核糖核酸连续地连接到双链DNA分子的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，形成长链的核酸分子。 (1) 大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的作用： ①DNA缺口平移，制备DNA探针。 ②用于DNA序列分析。 Klenow酶的主要用途： ①DNA放射性标记。 ②合成cDNA的第2链。 ③补平内切酶切割双链DNA分子形成的粘性末端。