实验纤维素酶活力的测定.doc

实验 纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）实验目的掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定的方法。? 二、实验原理 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 三、试剂1. 25mL比色管2. 722型分光光度计3. 滴管4.水浴锅5.移液枪6.电炉 1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g加水500mL，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠050g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000mL。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2.0.1mol/L pH4.5乙酸乙酸钠缓冲溶液。3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。? 4. 葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100mL， 此溶液含葡萄糖1.00mg/mL。 5.酶液：将0.05g酶溶解定容至50 mL，从中取出1.0mL再定容至100mL，待。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制） 四、实验步骤1.标准曲线的绘制：分别吸取0.20，0.4，0.6，0.8，1.0葡萄糖于支2比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL，在沸水浴中煮沸显色10，冷却，加蒸馏水21mL，摇匀。以空白管，在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖g数为横坐标，绘出标准曲线。 3.0 3.0 3.0 实验操作 沸水浴加热10min，冷却后，加水定容，摇匀，比色测定 吸光度A550nm 0.0 2.空白管的测定1.0mL酶液，沸水浴5，冷却加30.5%CMC-Na，与样品管同时放入50水浴30。其它操作同样品管。3.样品的测定：0.5%羧甲基纤维素钠溶液3mL，酶液1mL，于50水浴中糖化30，取出，立即于沸水浴中煮沸10使酶失活，得糖化液，却加入3mL 3,5-二硝基水杨酸显色液，再沸水浴10，冷却后加水定容至25mL，混匀，550nm处测OD值μg数。? 、结果在上述条件下，1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成微克葡萄糖定为一个活力单位。纤维素酶活力单位（μg / mg·min）＝N—酶液的稀释倍数30—糖化所用时间无论是标准液还是样品液，都要去除葡萄糖外的其他各种成分的对OD值的影响。得到的标准曲线经过坐标原点。用移液管或移液枪加各试剂时，不能将移液管或移液枪头混用。比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL，在沸水浴中煮沸显色10，冷却，加蒸馏水21mL，摇匀。 Determination of Cellulase Activity 1. Purpose of Experiment Master the principle of determination of reducing sugar,Learn the method of determinating cellulase activity using 3,5-dinitro salicylic acid method. 2. Experimental Principle Cellulase can hydrolyze cellulose to produce reducing sugar such as cellobiose and glucose. Those sugars can reduce nitro of 3,5- dinitro salicylic acid into amino to form orange yellow amino compounds, so colorimetric method can be used to determine the reduction product expressed as cellulase activity . 3. The Main Instruments and Reagent 3.1 Experimental Instrument (1) 25mL colorimetric tube type (2).722 spectrophotometer (3) dropper (4) bath (5) pipette (6) electric furnace 3.2 Reagent (1) 3,5- dinitro salicylic acid solution: Weigh 10 g 3,5- two nitro salicylic acid, dissolved in 200mL of dist