dns法测定纤维素酶实验方法总结.docx

dns法测定纤维素酶实验方法总结 　　实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验　　一、实验目的　　1、了解纤维素酶的生产工艺和原理2、掌握液体发酵和固体发酵工艺　　3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理二、实验原理　　纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。　　以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量，可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。三、材料与试剂配制　　1、生产菌种：黑曲霉　　2、斜面培养基：酵母膏%，蛋白胨%，可溶性淀粉1%，葡萄糖%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水配制，。　　3、人工海水：NaCl=24g/L;MgSO4·7H2O=g/L;NH4NO3=1g/L;KCl=g/L;NaH2PO4=g/L;Na2HPO4=g/L,。　　4、微量元素液：FeSO4·7H2O/L，MnSO4·H2O/L，ZnSO4·7H2O/L，CoCl2/L，加蒸馏水200ml使之溶解。　　5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源3g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1g，蛋白胨作有机氮源，人工海水100ml，自然pH值。　　6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5g，人工海水12ml，自然pH值。　　7、6%DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500ml水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g，,5g苯酚，5g无水亚硫酸钠，加热搅拌溶解，冷却后定容至1000ml。储存在棕色瓶中放置一周后使用。　　8、mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液　　/L柠檬酸钠溶液100mL:称克柠檬酸钠(柠檬酸钠的分子量为)，约20L蒸馏水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。　　/L柠檬酸溶液100mL:称克柠檬酸(柠檬酸的分子量为)，约20L蒸馏水溶解后，转入100mL溶量瓶，定容至刻度。　　的柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液100mL:量取/L柠檬酸钠溶液54mL和/L柠檬酸溶液46mL混合摇匀。　　91%CMC-Na溶液　　称取克羧甲基纤维素纳，用pH的柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液加热溶解。10标准葡萄糖溶液　　1mg/mL葡萄糖溶液250mL:准确称取无水葡萄糖250mg，溶解定容到250ml。11、主要仪器：恒温培养箱，摇床培养箱，可见光分光光度计、冷冻离心机、电子天平等。四、实验步骤　　1、培养基配制　　分别按上述方法配制液体发酵培养基和固体发酵培养基，121℃灭菌20分钟。2、孢子悬液的制备：将斜面培养基上的曲霉孢子用少量无菌人工海水洗下，利用玻璃珠在磁力搅拌下搅拌15~20分钟，充分打散孢子，稀释成5x107个/ml左右的孢子悬液。　　2、液体发酵产酶试验　　按6%接种量将浓度约为5×107个/ml的菌株孢子悬液接入已灭菌的液体发酵培养基，于35℃、180r/min条件下摇床培养6天。发酵液4℃、5000r/min离心15min，上清液稀释10倍，测定发酵液中的酶活力。　　3、固体发酵产酶试验　　7　　100ml三角烧瓶装5g已灭菌的固体发酵培养基，按1:3(v/w)接种量将浓度约为5×10　　个/ml的菌株孢子悬液，于35℃恒温培养箱中培养，接种48小时后隔天翻曲一次，第四或第五天补充无菌水保持基质水分。培养6天后，取发酵成熟曲1g，加蒸馏水10ml，搅拌均匀，30℃，浸提lh，双层纱布过滤，滤液经4℃，5000rmp离心15min，上清为粗酶液。测定时适当分级稀释，使OD540在~范围。　　4、酶活力测定及酶活力定义葡萄糖标准曲线绘制　　准确称取无水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。分别吸取此液,,,,ml至5个25ml的比色管中，用蒸馏水定容到25ml(即加水24,23,22,21,20ml)　　再分别吸取上溶液各于比色管中，各加试剂，煮沸5min。标准葡萄糖DNS含糖量　　OD540　　1-0　　2-　　3-　　4-　　5-　　6-　　以糖含量为横坐标，A540为纵坐标，绘制标准曲线。　　内切葡聚糖酶(CMCase)酶活：取适当稀释的酶液ml，加入ml1％(W/V)的CMC-Na溶液(溶于mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液，pH)，60℃反应30min，加入mlDNS终止反应，沸水浴显色5min，测定OD540。以灭活酶液作对照。　　滤纸酶(FPA)酶活：取50mg(1Χ6cm)新华滤纸，加入酶液ml，再加入p