白药子黄酮提取及抗氧化活性研究.doc

PAGE PAGE 1 白药子黄酮提取及抗氧化活性研究 　　摘要：目的利用响应面分析法优化白药子黄酮提取工艺，并对其抗氧化活性进行测定。方法在单因素实验的基础上，应用Box-Behnken设计试验，研究四个自变量对白药子黄酮产量的影响。采用邻二氮菲-Fe2+-H2O2法、DPPH法和ABTS法进行抗氧化活性研究。结果白药子黄酮最佳提取工艺：回流温度82℃、料液比1：28（g/mL）、乙醇体积分数为60%、回流时间30min。此条件得白药子黄酮含量为13.17mg/g（理论值为13.25mg/g），RSD=0.19%。其清除?OH、DPPH?和ABTS的IC50值分别为0.12mg/mL、0.047mg/mL、0.36mg/mL，其中提取液对DPPH?清除作用最为显著。结论白药子黄酮提取物具有较强的抗氧化活性。 　　关键词：白药子；黄酮；提取工艺；抗氧化活性 　　中图分类号：R961文献标识码：A文章编号：1004-4949（2013）03-0-03 　　白药子为防己科千金藤属植物头花千金藤StephaniacepharanthaHayata的干燥块根[1]。白药子始见于《开宝本草》，具有散瘀、消肿、止痛、清热解毒之功效，多用于痈疽肿毒、腮腺炎、毒蛇咬伤、跌打肿痛、咽痛喉痹等[2]。黄酮类化合物对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和清除自由基、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无毒副作用[3]。本文在单因素实验基础上，利用响应面分析法对白药子黄酮提取工艺进行了优化，并采用清除?OH、DPPH?、ABTS+自由基进行了体外抗氧化活性研究，为白药子开发利用提供理论依据。 　　1材料、试剂和方法 　　1.1材料、试剂及仪器 　　材料：白药子采自甘肃省陇西县。将白药子清洗干净，烘干，粉碎过60目筛，备用。 　　试剂：芦丁、2，6-二叔丁基对甲苯（BHT）（中国医药（集团）上海化学试剂公司），二苯代苦味肼基自由基（?DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）（Sigma公司），抗坏血酸，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠、三氯乙酸等均为分析纯。 　　主要仪器：WFJ2100型可见分光光度计（上海尼龙柯仪器有限公司）；ER2000A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；HH-4型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）等。 　　1.2方法 　　1.2.1黄酮提取流程 　　原料→洗净→烘干→粉碎过60目筛→最佳工艺条件下回流提取2次→合并滤液→定容→得黄酮备用液 　　1.2.2黄酮含量测定[4] 　　准确吸取0.16mg/mL芦丁标准液0.00、0.20、0.60、1.20、1.80、2.40、3.00、3.60mL，分别10mL容量瓶中，依次加入5%的NaNO2溶液0.4mL，摇匀，放置6min，再加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL，摇匀，放置6min，再加入5%的NaOH溶液4.0mL，用75%的乙醇溶液定容，放置15min。510nm处测其吸光度，得吸光度y与芦丁浓度x（mg/mL）的回归方程：y=13.541x-0.00227（R2=0.9998） 　　将样品溶液稀释至一定浓度，精确吸取1mL于10mL容量瓶中，按上述方法测定吸光度，代入回归方程计算样品溶液总黄酮质量浓度。 　　1.2.3响应面法实验设计 　　在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，选择影响白药子黄酮含量的时间、温度、料液比、乙醇体积分数四个实验主要因素，考察白药子黄酮含量，实验因素水平设计见表1。 　　根据中心组合实验设计方案进行实验，采用SAS9.2统计分析软件对实验数据进行回归分析，确定出最佳提取工艺。 　　1.2.4白药子黄酮抗氧化实验 　　1.2.4.1清除?OH自由基实验[5] 　　采用邻二氮菲-Fe2+-H2O2法测定，测定波长为510nm，按表2加样。对照品为Vc、BHT（以下实验相同）。 　　1.2.4.2清除DPPH?自由基实验 　　准确移取浓度为0.1000mg/mL的DPPH?自由基溶液1.20mL，分别加入不同质量浓度白药子总黄酮提取液，用95%乙醇补至总体积为5.0mL，混合均匀，常温反应30min后于517nm处测定吸光度A1；同上法，95%乙醇代替DPPH溶液，测定吸光度A2；同上法，95%乙醇代替样品液，测定吸光度A。 　　1.2.4.3清除ABTS自由基实验 　　将5mL7mmol/L的ABTS甲醇溶液和0.088mL140mmol/L的过硫酸钾溶液混合均匀，室温避光反应12-16h，然后溶液用甲醇稀释，使其溶液在734nm处的吸光度值为0.70±0.02，即得ABTS+自由基工作液。分别移取4mLABTS+溶液和0.5mL不同质量浓度的样品溶液，混匀，室温