浙江大学生物化学实验甲 2011-蔗糖酶蛋白质浓度和酶活性测定的原理课件.ppt

蔗糖酶蛋白质含量和酶活力的测定原理 一、蔗糖酶蛋白质含量的测定—— 福林-酚法（Lowry法） ????? 1.1、Lowry法的原理 Lowry法是由两组试剂作用于蛋白质产生有色物质，通过比色测知其蛋白质含量的方法。 这两组试剂包括磷钼酸及磷钨酸的混合试剂（福林-酚试剂）和碱性铜试剂。 其测定蛋白质含量的原理如下： 一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 1.2、 比色法的测定原理 磷钼蓝和磷钨蓝的OD640 值与溶液中的蛋白含量成正比， 如以蛋白含量为横坐标， OD640值为纵坐标，二者 之间的关系应为直线。 由未知样品的OD640值，通过标 准曲线，用作图法即可知道未知 样品的蛋白含量。如右图： 一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 1.3、Lowry法的特点 Lowry法测得的含量为蛋白质的相对含量，样品浓度需按标准曲线进行校正。 可测范围：2-100微克。 操作比较简单，重复性较好，是至今生物化学研究中应用最多的方法。 缺点：酚类和其它具有还原性的物质对显色反应有干扰， 另外，该法标准曲线线性不是很好，因此每次测定均需制作标准曲线。 一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 1.4、材料及试剂 1、实验材料 未知蛋白样品 2、实验试剂 标准蛋白质溶液配制见P89。 福林-酚试剂的配制及注意事项解说见P89。 1.5、实验步骤 实验中的注意事项及解说详见实验讲义P-89。 一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 1.6、试验结果及处理 1、标准曲线的制作。 将所得的试验数据以蛋白含 量为横坐标， OD640值为纵 坐标，绘制标准曲线。 2、未知样品蛋白含量的确定。 根据未知样品的OD640值，通过标准曲线求出未知样品的蛋白含量。 二、蔗糖酶活力的测定原理 蔗糖酶活力单位（units）：在50℃，pH4.6条件下，每分钟能产生1mg还原糖的酶量。 * * 碱性铜试剂 铜-蛋白质络合物 （双缩脲反应） 试剂甲 紫红色 蛋白质 磷钼酸-磷钨酸 磷钼蓝 + 磷钨蓝 蓝色，640nm处有特征光吸收，OD640 值与溶液中的蛋白含量成正比, 可据此通过比法色测定蛋白质的含量。 (福林-酚试剂) 试剂乙 铜-蛋白质络合物 蛋白含量 (ug) OD640 未知 蛋白含量 (ug) OD640 未知 还原糖 + 3，5-二硝基水杨酸 糖酸 + 氨基化合物 OH- △ 红棕色，540nm处具特征光吸收，OD540值与还原糖含量成正比，可据此进行比色测定。 （DNS试剂） 蔗糖 葡萄糖 + 果糖 蔗糖酶 H2O CH2OH OH O OH OH HO CH2OH O HO OH HO CH2OH + *