浙江大学生物化学实验甲 定磷法测定RNA含量课件.ppt

定磷法测定RNA含量 1、原理 1、核酸的水解 定磷法测定RNA含量 2、定磷法的原理 a、比色法的测定原理 由于钼蓝的OD660值与溶液中的磷含量成正比，因此，如以磷含量为横坐标，OD660值为纵坐标，二者之间的关系应为直线。如下图： 定磷法测定RNA含量 未知样品磷含量的测定： 由未知样品的OD660值， 通过标准曲线，用作图 法即可知道未知样品的 磷含量，如右图所示： b、定磷法的特点： 定磷法测定时如用抗坏血酸作还原剂，比色的最适范围为1-10微克无机磷。 钼蓝反应极为灵敏，微量杂质的磷、硅酸盐、铁离子、以及酸度偏高偏低均会影响测定结果。 定磷法测定RNA含量 3、RNA含量的测定原理 由于RNA的含磷量为9.5%，因此，将测得的含磷量乘以100/9.5即为RNA的量。 4、定糖法的定性测定原理 2、材料与试剂 1、实验材料 RNA粗制品 定磷法测定RNA含量 2、实验试剂 实验试剂配制中的注意事项参P-139。 3、实验步骤 实验中的注意事项及解说详见实验讲义P-140。 4、实验结果及处理 1 、无机磷标准曲线的制作 将所得的实验数据以磷含量为横坐标，光密度为纵坐标，画出标准曲线。 定磷法测定RNA含量 2 、样品测定 a、RNA的定性鉴定 认真观察颜色变化并解释实验现象。 b、RNA的定量测定 记录样品的光密度值，根据下式计算RNA的含量： 0 * RNA 浓硫酸 H2O 浓硫酸 H2O 核苷酸 核糖（定糖法测定） 磷酸 （定磷法测定） 含氮碱基（ 嘌呤或嘧啶， 260nm处有特征光吸收， 可据此测定核酸的含量。 磷酸 + 钼酸 磷钼酸 钼蓝 H+ 还原剂 （抗坏血酸） 蓝色，660nm处有特征光吸收，OD值与无机磷含量成正比，可据此通过比色法测定磷含量。 OD660 未知 磷含量（ug） 戊糖 糠醛 绿色复合物 苔黑酚-FeCl3 △ H+ RNA（ug/mg鲜重）= 标准曲线上查得的含磷量（ug） 样品鲜重（mg ） × 稀释倍数 × 1000 95 *