浙江大学生物化学实验甲酵母蔗糖酶的制备、纯化步骤-离子交换.doc

酵母蔗糖酶的制备 一、酵母蔗糖酶的制备 1.缓冲液抽提 称取10克干酵母粉，加3克石英砂，于研钵中研磨约2分钟；再加30毫升0.02 mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液（以6毫升1份分次加），边加边研磨至成浆状，将匀浆转移到50ml离心管中，于8000转/分离心20分钟，形成三层；用滴管插入取水层（中层）于50ml离心管中，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中，量体积，记为F1。留0.5毫升以测定酶活力和蛋白质含量（Fraction I），其余转入50ml离心管中用于加热纯化。 2. 加热纯化 将上清液置于50℃水浴中保温30分钟，随时摇动；然后于冰—水浴中冷却，以10000转/分离心10分钟，取上清液到量筒中，量体积，记为F2。留0.5毫升测酶活力及蛋白质含量（Fraction Ⅱ）。其余用于醇分级分离。 3. 醇分级分离 于上清液中加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，冰上进行，慢慢滴加，边滴边摇（控制在6-8分钟加完）。充分混匀后，于冰-水浴中放置20分钟；以10000转/分离心10分钟，取沉淀，用4-5毫升0.05mol/L、pH7.3的Tris-HCl缓冲液（含0.025mol/LNaCl）溶解沉淀，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中量体积，记为F3。留1毫升测酶活力及蛋白质含量（FractionⅢ），其余用于柱层析。样品保存于冰箱中备用。 4. DEAE-Sepharose柱层析分离纯化 柱规格：1×20（cm，直径） 流速：3ml/10min 上清（约3~4ml）加到DEAE-Sepharose柱上进一步分离纯化。流速3ml/10min，洗脱液：0.02 mol/L pH7.4的Tris-HCl，在0～1mol/L NaCl下进行线性梯度洗脱，收集：3ml /管。 二、各步提取液蛋白质含量的测定 1. 蛋白质含量标准曲线的制作 项 目 试管号 0 1 2 3 4 5 蛋白质含量（μg） / 50 100 150 200 250 蛋白质标准液（ml） / 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无离子水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 / Follin酚甲液（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 充分混匀，于室温（20~25℃）放置10分钟 Follin酚乙液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀，于30℃水浴保温30分钟 OD650（nm） 蛋白质标准液浓度：250ug/ml 2. 各步提取液蛋白质含量测定 项 目 试管号 空白 Fraction Ⅰ（1：10） Ⅱ（1：5） Ⅲ（1：2） 1 2 3 4 5 6 7 稀释酶液（ml） 0 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 无离子水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.9 0.8 0.9 0.8 Follin-酚甲液（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 充分混匀，于室温放置10分钟 Follin-酚乙液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀，于30℃水浴保温30分钟 OD650nm 蛋白质含量（μg） 平均值（μg） 提取液蛋白质总含量（mg） 三、各步提取液酶总活力及比活力测定 1. 葡萄糖标准曲线的制作 项目 试管号 0 1 2 3 4 5 6 8 含糖量（） 葡萄糖标准液（ml） / 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 无离子水（ml） 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 DNS试剂（ml） 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 混匀，于10