浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析..doc

酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析 一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介 蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖 水解为果糖和葡萄糖的反应。 酵母蔗糖酶分子量约270000D，pI约5．0，最适pH4．6，耐酸和热，50℃保温30min仍具有相当的活力，最适温度37℃。耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。 二、酵母蔗糖酶的分离纯化 本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。加热纯化。乙醇分级沉淀。纤维素柱层 析分离纯化。 ㈠、前三步分离纯化的原理如下： 甲苯 石英砂 离心 上层（甲苯层）：脂溶性物质 酵母细胞 破细胞 中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等 研磨 下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等 取中层 50水浴中 使热不稳定蛋白变性 离心 上清：蔗糖酶、可溶性糖等 （水层） 保温30分钟 沉淀：变性蛋白 取上清 加乙醇 使蔗糖酶沉淀 离心 上清：杂蛋白及可溶性糖等 冰浴中20分钟 沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等 ㈡、纤维素柱层析分离纯化的原理 离子交换柱层析分离混合物的基本原理 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和 相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。 离子交换层析是一种液-固相层析技术。其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素、强碱型的离子交换树脂等。反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。离子与交换剂的静电结合作用具如下特点： — 选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。 + 遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大， 则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行 — 可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它 + （溶液中离子） 离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。 由于离子与交换剂的结合具有上述特点，因此如混合物 阴离子交换剂 中的各组分具有不同的电荷性质，或虽然电荷性质相同，但 电荷数不同，则各组分与离子交换剂的静电结合能力就不同。 与交换剂上带电基团电荷性质相反，带电荷数目越多的离子越容易吸附在交换剂上，带电数目越少，结合能力越弱。如离子所带的电荷与交换剂上带电基团的电荷性质相同，则完全不能结合于交换剂上，经洗脱液洗脱后，各组分即按离子结合能力由小到大的顺序依次洗脱出来，从而达到分离混合物的目的。 当用离子交换层析分离生物大分子如蛋白质、核酸时，由于生物大分子（蛋白质）常为两性电解质，在不同的pH条件下，组成蛋白质的AA解离情况不同，导致蛋白质具有不同的电荷性质和电荷数目，因此可通过调节溶液的pH，使待分离的蛋白质混合物选择性地吸附于离子交换剂上，再通过改变洗脱液的离子强度和pH，控制这种结合能力，从而使蛋白质混合物按结合能力由小到大的顺序依次从层析柱中洗脱下来。 本试验用pH7．3的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，在该条件下（高于酶的等电点），酵母蔗糖酶带负电荷，因此当用阴离子交换剂（DEAE-纤维素）进行分离时，酵母蔗糖酶结合于离子交换剂上，通过改变洗脱液中盐浓度的方法即可将酵母蔗糖酶洗