分子生物学-蛋白质的研究方法.pptx

蛋白质的研究方法;第一节蛋白质提取;目的蛋白研究基本流程;一、蛋白质样品的提取;;1.细胞的破碎;2.去污剂处理溶解膜蛋白;3.蛋白质分子的稳定;细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎

由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化

成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活

性，如巯基蛋白;蛋白质的环境因素;4.离心去除细胞碎片;层析的基本理论;假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一

定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂

A物质在两相中相互扩散

A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两

相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数

;二、分配层析的机理;（3）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平衡的速度很快，并且A物质的存在不影响B物质的分配性质，反之亦然

（4）在该溶剂系统中，A和B两物质的分配系数分别设为：;如果在层析开始时，在第一层的S相中同时加入A和B两种物质，加入的量均为1。根据分配定律，M加入后，在两相中立刻进行分配，并且很快达到分配平衡。第一次分配前后A和B物质在S和M相中的量为：;A和B物质在层析柱中

1.分配10次；2.分配20次；3.分配30次;二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为：

层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散

层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行

;1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么，

在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000

次分配。;塔板理论的要点：

分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为

一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的

条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的

在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩

散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快

体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。

待分离物质的存在也不影响其他物质的分配

在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可

通过计算求得;6.蛋白质的检测和鉴定;

第二节蛋白质的定性定量分析;蛋白质定性分析(qualitativeanalysis);??、蛋白质的含量测定;蛋白质元素组成的特点;1.紫外光谱(A280)吸收法;原理;优点;计算方法;2.考马斯亮蓝G-250检测法;原理;所需时间;计算方法;3.Lowry检测法;原理;优点;计算方法;4.BCA(二喹啉甲酸)检测法;原理;优点;第三节蛋白质相对分子量测定;一、SDS测定蛋白质的相对分子量;3.SDS基本原理;SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1mmol/L时，SDS与蛋白质的结合比例为1.4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异;SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系;在不连续电泳系统中，含有三种离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同pH的缓冲溶液

所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分及pH不一样;凝胶层的不连续性：

浓缩胶(stackinggel)

分离胶(separatinggel);;pH的不连续性：

在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，是为了

控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率

浓缩胶pH：6.8

分离胶pH：8.8

缓冲液pH：8.3;5.SDS测定分子量的操作;;6.注意事项;

第四节测定蛋白质的等电点;等电点(isoelectricpoint,pI);;ReadyStripTMIPGStrips;第五节

蛋白质的免疫印迹分析;印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术

1975年，EdwenSouthern提出了分子印迹(渍)的概念

目前这种技术已被广泛用于D