现代分子生物学蛋白质.ppt

共定位：质粒共表达Differentframesfromtime-lapsemicroscopyareshownforCID-GFP(DrosophilaCENP-A,centromeremarker)coexpressedwithH2B-mRFP(chromosomecounterstain)at1,64,83and138minutes.Purpleindicatescelloutlinestakenbytransmissionlight.4)互作蛋白的鉴定N端测序:Edmansequncing需要大量纯化的蛋白质N－末端封闭质谱(masspectrometry,MS)分析常用,基因组序列MALDI-TOFMS:matrix-assistedlaser-desorption/ionizationtime-of-flightESI-MS/MS:nano-electrosprayionizationtandemMS(Q-TOF)MALDI-Q-TOF,TOF/TOF生物样品离子化方法5)蛋白互作的验证酵母(细菌)双杂交体外:Westernblot体内:细胞试验RNAi抑制Rab6基因的表达对血细胞吞噬功能的影响功能体内Rab6基因过量表达对血细胞吞噬功能的影响Rab6基因沉默对病毒感染的影响互作片段VP466Rabtropomyosinactin900-1020bp信号通路VP466-tropomyosin-actinVP466：感染必需蛋白信号通路VP466-Rab6-actinRab6N端：与VP466互作必需体外体内VP466为Rab6的GAP信号通路VP466-Rab6-actinVP466激活Rab6，Rab6影响actin构象，促进吞噬信号通路VP466-Rab6-actin果蝇：Rab6-actin果蝇：Rab6-actin细胞吞噬RanVP466Ranmyosinactin细胞吞噬tropomyosinRabRNAioverexpressionNP小分子siRNA小G蛋白（Rab，Ran）与骨架蛋白直接作用调控吞噬病毒双功能蛋白蛋白质复合体标记病毒感染Rhodamine-Phalloidin3.细胞内蛋白质标记（proteinlabelinginvivo）蛋白质互作：生化数据，体外分析细胞、个体观察：蛋白质标记12荧光标记(fluorecencelabeling)1常用：小分子有机染料与各种抗体相连接或特异的荧光标记物，研究2各种目的蛋白3需要对细胞进行固定等操作4进展：直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧5光标记物6荧光蛋白：非侵入性的活体细胞成像7荧光蛋白-目的蛋白融合表达：过量表达8目的基因失活突变体（株）91）荧光标记物2）标记蛋白技术3）应用1）荧光标记物小分子有机染料

分子量小于1KD与生物大分子共价连接对其进行标记染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性利用：扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。有数百种荧光染料商品，如DAPI，FITC，Rhodamine，Hoechst，PI，DTAF，phalloidin等多与抗体联用荧光蛋白

最早：藻胆蛋白（phycobiliproteins），蓝藻中提取的触角光合色素含有多种胆汁三烯生色基团，生色基团包裹在一种基质结构中，将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。蛋白分子量200KD，限制了它们在细胞内的扩散，只能与抗体联用，在流式细胞或ELISA中用来检测细胞表面的蛋白质分子后来：维多利亚发光水母（Aequoreavictoria）中发现GFP，生物成像发生革命性改变，单独表达GFP或与其它蛋白融合表达