家蚕30K蛋白的结构功能及其五龄血浆蛋白质组学的研究.pdf

摘 要 摘 要 家蚕不仅是一种重要的经济昆虫，同时也是研究昆虫生理和生化的重要模 式生物。家蚕具有开放的血浆循环系统，特别是在五龄幼虫的变态发育时期， 各种蛋白质由脂肪体合成并分泌到血浆中执行相应的功能，这些蛋白质对研究 家蚕生理生化的机制非常重要。 然而，对这些蛋白质的研究尚不透彻，如家蚕血浆中存在着一类分子量在 30kDa左右的脂蛋白，被称为家蚕30K蛋白家族。它们无论是核苷酸序列还是蛋 白质序列都很相似、同源性高，它们从脂肪体合成，之后分泌到血浆中，而且 只从五龄幼虫变态发育时期开始特异表达。推测它们的功能可能涉及到脂肪酸 的转运、胚胎发育、细胞程序化死亡及血浆天然免疫反应等等，但是有关家蚕 30K蛋白的具体功能仍不清楚。 我们对家蚕血浆 30K 蛋白进行天然分离并提纯、结晶，借助硒代甲硫氨酸 和 native 重组蛋白的表达、纯化结晶，使用多波长反常散射法确定了 30K 蛋白 Bmlp7 的相位并解析了结构，其分辨率为 1.91 Å。Bmlp7 表现为典型的 α+β结 构，由两个完全分离的结构域构成：all-α 的N 端结构域（NTD ）和 all-β 的 C 端结构域（CTD ）。其中，CTD 属于 β-三叶草超家族结构域。与已知结构的 14 个 β-三叶草家族成员相比较，30K 蛋白家族为一个新的三叶草家族。推测 Bmlp7 的NTD 可能具有结合脂的能力，而 CTD 存在结合糖的潜在位点，因而可能间 接地参与昆虫天然免疫反应。然而，我们的实验未能检测到它与糖或者脂分子 结合，可能该蛋白的天然底物不是我们试验中用的的糖或者脂分子，对这一蛋 白的功能研究还需要进一步的深入研究。 五龄血浆蛋白质中除了 30K 蛋白家族以外，还有很多功能和性质都未知的 蛋白质。我们除了可以在基因组水平上研究家蚕基因的种类和功能之外，更可 以从整体的角度分析家蚕血浆内蛋白质，同时从个体的角度对重要功能的蛋白 质一一进行结构和功能的研究，从而揭示该蛋白质在家蚕生长发育时期中的重 要作用。我们利用两种方法并行研究了家蚕在五龄幼虫阶段所表达的血浆蛋白 质组。以一维 SDS和不同 pH 值的血浆溶液为基础分别进行胶内和溶液 酶解，并结合多维液相色谱与质谱联用技术（LC-MS/MS ）进行结果分析。鉴 定出的 289 个蛋白质等电点分布从 4-12 ，大多分子量分布在 10-60kDa，它们的 可溶性都很高。这些蛋白质通过 NCBI 比对和GO 分类成 12 类，大多数蛋白质 都与储存、防御、转运和代谢等相关，这与这个时期的生理生化变化是密不可 分的。我们对其中一些高丰度蛋白质进行了进一步的分析，如 30K 蛋白从五龄 初期出现到蚁蚕时期消失，可能与它们的功能密切相关。对血浆蛋白质组的研 I 摘 要 究不仅可以从整体了解家蚕血浆内蛋白质的成分和分布，以及它们与家蚕生理 周期的关系，而且也为以后的研究这些蛋白质的功能打下了基础。 关键词：家蚕 晶体结构 30K 蛋白 β-三叶草超家族 糖结合位点 血浆 蛋白质组 II Abstract Abstract The silkworm Bombyx mori has been domesticated as not only a major economic insect, also its ability to metamorphosis from a worm to a moth makes it a good model for lepidopteran genetic and molecula