分生第五课功能蛋白质组学研究方法.ppt

* * * * 另一类是技术上的假阳性 即由于双杂交技术上的局限而鉴定出的蛋白质与蛋白质间的相互作用。 包括筛库过程中自发升高的BD-x融合蛋白自我激活导致的假阳性，在BD-x融合蛋白不存在的情况下AD-Y融合蛋白单独激活报告基因，导致的假阳性,以及酵母中其他蛋白质作用引起的假阳性等。 因此，虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用,但其中部分蛋白质在生理状态下可能不发生相互作用,双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性,这种可能性还必须经过其他实验验证,尤其要与生理功能研究相结合,否则可能会误入歧途。 酵母双杂交体系的新发展 传统酵母双杂交体系的改建 根据酵母的营养缺陷,发展了多重筛选机制 表达载体构建的改进 将蛋白的相互作用场所从核内移至细胞膜 哺乳动物细胞双杂交系统 三杂交系统的产生：用于研究蛋白和RNA间的相互作用。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 功能蛋白质组学 功能蛋白质组学是指对蛋白质间、蛋白质与 DNA/RNA 间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容， 由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。 蛋白质芯片技术 噬菌体展示技术 酵母双杂交系统 蛋白质芯片 蛋白质芯片是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。 蛋白质芯片反应结果的检测 荧光标记是芯片息采集中使用最多也是最成功的报告标志。对杂交反后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件进行分析，将荧光信号转成数据，即可获得有关生物信息。 蛋白质芯片分类 根据固定介质的不同,可以分为两大类: 化学型蛋白质芯片（SELDI-TOF-MS蛋白质芯片） 生物型蛋白质芯片（如抗体、受体、配体等）； 根据片基材料的不同可以分为： 膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。 目前常用蛋白质芯片有： 1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片 2. 抗体芯片 3. 靶蛋白质芯片 4. 液相蛋白质芯片 SELDI-TOF-MS蛋白质芯片 表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption /ionization time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS ）蛋白质芯片由３部分组成：蛋白质芯片、阅读器和分析软件。 蛋白质芯片是核心部分，芯片上固定的介质可以是阴离子、阳离子、疏水性、亲水性、金属等，根据蛋白质的化学特性而有选择性地捕获特异的蛋白质。 ＳＥＬＤＩ技术的基本原理: 将待测样品滴到芯片表面(血清、尿液、分泌液、细胞裂解液等)，通过亲合作用样品中的某些蛋白质被吸附到芯片的固相基质表面上，用缓冲液洗去芯片上的杂质蛋白和其他污染物，然后在芯片上加入能量吸收分子（energy absorbing molecular,EAM），芯片干燥后，在真空管中用激光轰击，蛋白质在吸收能量后被解析发生离子化， 在电场力作用下脱离芯片表面， 被离子检测器所检测。检测结果经过软件分析处理后， 可绘制出质谱图，显示相关蛋白质的分子量、含量等信息。 抗体芯片 抗体芯片主要研究在不同生理或病理状态下蛋白质水平的量变。微型化、集成化、高通量化是抗体芯片重要特点。 芯片上排列了许多已知蛋白质的单克隆抗体，这些单克隆抗体对应的蛋白质（抗原）都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡等广泛的领域。 抗体芯片检测的结果不是蛋白质的绝对含量而是目的蛋白质在两个样品之间的相对峰度。 靶蛋白质芯片 主要用于蛋白质相互作用研究、蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。 靶蛋白质的获得： 1.化学合成； 2.基因工程表达蛋白质并进行纯化点样制作芯片； 3.将活的生物体(如细菌、酵母等)在芯片上原位表 达蛋白质（living芯片） 。 4.将核酸固定在芯片介质中，然后利用不依赖细胞 的体外蛋白表达系统，在原位合成靶蛋白。 液相蛋白质芯片 是一种新型的、高度灵活的多元蛋白质研究平台，可以适用于蛋白质组研究、临床研究和药物研究中的各种蛋白质分析。 液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液