蛋白质组学及其在微生学研究中的应用.ppt

第11章 蛋白质组学及其在微生物学 研究中的应用 主要内容 第一节 引言 第二节 蛋白质组学研究基本技术 第三节 微生物蛋白质组学 背 景 第一节 引言 蛋白质组学的概念 蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出， 被定义为：一个基因组/一种生物或一种细胞/组织所表达的全部蛋白质。 对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 。 在空间和时间上动态变化着的整体。 蛋白质组学(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 大规模的蛋白质分析过程 样品制备 是蛋白质组研究的第一步也是最关键的一步。 蛋白质分离（技术）： 二维电泳（核心技术）、多维色谱 蛋白质分析与鉴定（技术）： 质谱技术（核心技术）、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术和噬菌体表面展示技术等。 ★ 蛋白质组发展的瓶颈是缺乏自动化的蛋白质分析的完整途径。 第二节 蛋白质组学研究基本技术 典型的蛋白质组学研究常分为四个步骤： 蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴定和解析蛋白质技术的进步。 重要技术突破主要包括三点： 固相化PH梯度二维电泳（IPG-2-DE)的发明与完善； 生物质谱，即应用软电离技术对生物大分子进行分析的质谱技术的发展； 生物信息学发展。 一、蛋白质组研究中的蛋白质分离 （一）、二维（双向）凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)： ◆ 利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。 原 理 ◆第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦电泳技术(IEF)将蛋白质混合物按照等电点高低进行分离, 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)按照相对分子质量大小进行蛋白质分离。 ◆1975年首先由O’Farrell等创立。 特 点 可分离10～100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配 第一向IEF电泳 固相pH梯度等电聚焦的优点 ◆克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 ◆稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。 第二向SDS电泳 垂直板电泳 水平超薄胶电泳 双向电泳典型过程包括： ①蛋白质样品制备：要防止蛋白质酶降解蛋白质。 ②上样 一种是IPG胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上样。 别一种是将样品与重泡胀液混合，在IPG胶条泡胀的同时样品出参入了胶条。 ③IPG的运行和平衡 ④SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑤胶上蛋白质检测和定量： 荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿，线性范围要远高地银染，与质谱兼容性好。 ⑥图像采集、分析及数据处理 2-DE技术的缺点 ◆ 所能分离的蛋白质的性质有一定限制，如蛋白质分离范围一般为8~200kD，对极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，包含信号蛋白和转录因子的低丰度蛋白质难于有效分离。 ◆ 在2－D胶上有些蛋白质点量太少，难以进行质谱鉴定；操作费时、费力，自动化程度低难于与质谱联用实现自动化性质联用。 2、新型非凝胶技术 ◆高效液相色谱法 High performance liquid chromatography，HPLC ◆毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE ◆液相等点聚焦和毛细管色谱 capillary electrochromatography ★ 特点： 自动化程度高、分辨率高，检测限低。 采用凝胶技术和非凝胶技术进行蛋白质组学研究的基本路线 在非凝胶分离技术中，高效液相色谱由于其分离原理多样，易于组合多维分离模式和与质谱直接联用而获得了广泛的研究和应用。 高效液相色谱的原理：溶于流动相中各组分经过固定相时，与固定相发生相互作用，由于相互作用大小、强弱的不同，各组分在固定相中滞留的时间不同，由此从固定相中流出的先后也不同，最终使不同组成成分得到分离。 经典的高效液相色谱系统由输液系统、进样系统、分离系统和检测系统构成。质谱起到了检测器的作用。 液质联用技术（LC-MS/MS） 根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。 二、生物质谱与蛋白质鉴定 （一）、基本原理 质谱技术的基本原