蛋白质组学及其在医学研究中的应用课件.ppt

蛋白質組學及其在醫學研究中的應用

一、概述

最早於1994年由澳大利亞一位博士後Wilkins提出,指的是“一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質。”整體性、動態性和系統性

RepresentationofaeukaryoticCell

定義：蛋白質組學(proteomics),就是從整體的角度,分析細胞內動態變化的蛋白質組成成份、表達水準與修飾狀態,瞭解蛋白質之間的相互作用與聯繫,揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律的一個新的研究領域。

Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.

二、蛋白質研究的簡要史

1975年雙向凝膠電泳技術1986年第一個蛋白質序列資料庫-SWISSPROT1997年出版了第一部蛋白質組學的專著2000年3月首次發表了一個生物體的完整蛋白質組2001年6月和2001年2月公佈了人類基因組框架圖和序列圖譜

三、蛋白質組學的研究內容

組成蛋白質組:一個細胞或組織或機體中所有蛋白質的時空表達狀況的分析功能蛋白質組:蛋白質的細胞定位、蛋白酶的活性、蛋白質與蛋白質相互作用的連鎖關係及其由此實現的信號傳遞與調控作用

四、蛋白質組研究的主要技術方法

1.樣品處理方法

（1）色譜（2）亞細胞分級（3）鐳射解剖單細胞水準樣品製備（4）電荷分級與親和分級（5）變性劑及表面活性劑的作用

2.二維凝膠電泳技術(2DE)又稱雙向電泳,是蛋白質組學研究中的核心技術之一,是目前常用的唯一一種能夠連續地在一塊膠上分離數千種蛋白質的方法完整的雙向凝膠電泳分析,包括樣品製備、等電聚焦、平衡轉移、SDSPAGE斑點染色、圖像捕捉和圖譜分析等步驟

Figure3.Silverstained2-Dgelsfromtissuesamplesofrabbithearts.

⑴基本技術原理:是在相互垂直的兩個方向上,分別基於蛋白質不同的等電點和分子量,運用等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDSPAGE),把複雜的蛋白質混合物中的蛋白在二維平面上分離展開。

第一向等電聚焦中使用IPG幹膠條,將蛋白質成分按其等電點經分離後均勻地分佈於不同的pH梯度。第一向分離後將膠條經平衡液平衡後轉移至第二向SDSPAGE中進行。

（3）檢測方法幾個關鍵因素:靈敏度(檢測限),線性範圍,穩定性和重複性常用的檢測方法主要有以下種：有機染料（最常用的是考馬斯亮藍）、銀染（最常用的是鹼性/二氨合銀法和酸性/硝酸銀法）、負染、膠體擴散染料、有機螢光團染料、金屬螯合染料

（4）凝膠分離蛋白質的回收常用的方法包括:直接提取,電洗脫,電印跡至膜上,凝膠內降解後提取的四種方法

（2）2DE遇到的困難酸性和鹼性蛋白質的分析,ＭＷ較小和較大的蛋白質的分析,低含量蛋白質的分析,高速度自動化,變性後分離不能反映原始狀態,疏水性較強的蛋白質分析,手工操作較多、經驗性強、可重複性差

3.蛋白質鑒定—質譜鑒定技術(MS)

基質輔助鐳射解析電離質譜(MALDIMS):利用基質吸收鐳射的能量使得固相的多肽樣品離子化電噴霧電離質譜(ESIMS):在噴射過程中利用電場完成多肽樣品的離子化

通過測量肽段離子相關參數,如飛行時間(ＴＯＦ),即可計算得到準確的肽段品質通過穩定同位素標記,還可以用質譜進行蛋白質的定量分析。質譜技術還可以用於鑒定蛋白質複合物組成、確定蛋白質翻譯後修飾的類型與發生位點等

4.蛋白質相互作用分析—酵母雙雜交技術分析蛋白質之間的相互作用及其方式,認識與特定生理活動相關的蛋白質網路,繪製出蛋白質相互作用的圖譜(interactionmapping),是功能蛋白質組學的重要內容。酵母雙雜交是一種在細胞內檢測蛋白質的相互作用的技術,無需分離純化蛋白質,是實現大規模高通量分析的主要方法

原理:真核轉錄因數含有兩個相對獨立的功能域:DNA結合(DNAbindingdomain,BD)和轉錄啟動(activationdomain,AD)。當兩者獨立存在時,無轉錄啟動功能,但兩者只要相互接近,即可啟動轉錄

存在問題：酵母雙雜交技術還存在假陽性和假陰性的發生率高的問題,而且對於不能進入核