《卫生微生物学检验》课件——04-化妆品中铜绿假单胞菌的检测.pptx
化妆品中
铜绿假单胞菌的检测
实验目的
2
了解铜绿假单胞菌的微生物学特性
掌握微生物实验技术基本原理及操作
熟悉铜绿假单胞菌的分离鉴定程序及方法
知识准备
3
铜绿假单胞菌惯称绿脓杆菌，为革兰氏阴性杆菌，属假单胞菌属。它在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力比其他菌强，抗干燥的能力也强。
知识准备
4
形态：革兰氏阴性杆菌，菌体长短不一；单端单鞭毛；动力阳性；无芽胞
特性：专性需氧；生长温度范围是25℃~42℃，最适生长温度35℃，4℃不生长
知识准备
5
在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属光泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜味；
在普通平板、血平板、麦康凯平板上可形成5种不同形态的菌落
知识准备
6
菌落呈灰绿色，大小不一，扁平湿润，边缘不规则呈伞状伸展，表面常可见金属光泽
典型型（麦康凯平板）
知识准备
7
产绿脓素
琼脂染成黄绿色
典型型（普通平板）
知识准备
8
知识准备
9
菌落中央凸起
边缘扁平
表面粗糙
粗糙型（麦康凯平板）
知识准备
10
知识准备
11
生化特性
氧化酶：+
葡萄糖的氧化（O/F）：O
枸橼酸盐利用：+
精氨酸双水解：+
明胶液化：+
硝酸盐还原：+
乙酰胺酶：+
吲哚试验：-
知识准备
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铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，在机体抵抗力低下，如AIDS、肿瘤、长期使用激素或免疫抑制剂等情况下易引起感染；
铜绿假单胞菌也是常见的医院感染病原菌，约10%的医院感染由本菌引起。
本菌可引起多种感染性疾病，如呼吸道感染，泌尿系统感染、皮肤感染、腹泻、中耳炎、角膜炎、心内膜炎、败血症等；
化妆品中微生物检验标准规定不得检出铜绿假单胞菌。
知识准备
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实验方法
14
样品的前处理
亲水性样品（水包油型）：灭菌生理盐水
疏水性样品（油包水型）：
取样品先加10mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在40-44℃水中震荡混匀10min，加入灭菌生理盐水75mL,在40-44℃水浴中乳化，制成1：10悬液；
或用均质器，将加有助溶剂、稀释液的样品放入均质器内，均质3-5min后，取上清液待检（上清液的稀释倍数为1:10）
实验方法
15
样品的前处理
膏、霜、乳剂半固体状样品
亲水性样品称取10g，加到灭菌的90mL生理盐水中，充分震荡混匀，放30-32℃水浴中静置15min；
疏水性的样品称取10g，放到灭菌的研钵中，加10mL霉菌液体石蜡，研磨呈粘稠状，再加10mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40-44℃水浴中充分混合，制成1:10的稀释液
实验方法
16
样品的前处理
固体样本
称取10g，加到灭菌的90mL生理盐水稀释瓶中，振荡混匀，使其分散混悬后，放30-32℃水浴中，15min后取出，充分震荡混匀，再放到30-32℃水浴中静置15min，取上清作为1:10的稀释液。
实验方法
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增菌培养
取样品稀释液加到SCDLP液体培养基中，置于36℃±1℃培养18h-24h，如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色
a.空白对照
b.铜绿假单胞菌
SCDLP液体培养基培养结果
实验方法
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分离培养
从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，置于36℃±1℃培养18h-24h
菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素
实验方法
19
染色镜检
挑取可以菌落，涂片，革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
铜绿假单胞菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，呈红色杆状
实验方法
20
氧化酶实验
用接种环挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在氧化酶试纸上，在30s内变为蓝色或蓝紫色为阳性，2min内不变色为阴性。
a.铜绿假单胞菌 b.大肠埃希菌
实验方法
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绿脓菌素试验
a.大肠埃希菌b.铜绿假单胞菌
向试管中加入氯仿3-5mL，充分震荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿中,用吸管将氯仿转移到另一试管中并加入1M的盐酸1mL，振荡静置
实验方法
22
硝酸盐还原产气试验
挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置于36℃±1℃培养24h±2h，观察结果
a.空白对照
b.大肠埃希氏菌
c.铜绿假单胞菌
小倒管中有气体，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
实验方法
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明胶液化试验
取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置于36℃±1℃培养24h±2h，取出置于4℃±2℃冰箱10-30min,观察结果
a.空白对照
b.挑菌培养后
c.铜绿假单胞菌4℃放置后
d.大肠埃希菌4℃放置后
呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试