GB/T 19438.2-2004H5亚型禽流感病毒荧光　RT-PCR　检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of avian influenza virus subtype H5 2004-02-14 发布 2004-02-15 实施 发布 GB/T 19438.2—2004 言 GB/T 19438—2004 《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分: ——GB/T 1943 1—2004 《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》； ——GB/T 1943 2—2004 《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; ——GB/T 1943 3—2004 《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; ——GB/T 1943 4—2004 《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A是资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位 ：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人:刘环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁。 T GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本部分规定了 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款 。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。 GB/T 1943 1—2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3缩略语 下列缩略语适用于本部分。 3. 1 荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 3.2 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3. 3 RNA 核糖核酸。 3.4 Tag酶 Taq DNA聚合酶。 3.5 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水。 3.6 DEPC 焦碳酸乙二酯。 4原理 采用TaqMa 方法，在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上，设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血 凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 。该探针的结合部位位于目的扩增片段 内部 。其中5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光 基团 （用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光信号 。反应进入退火阶段时 ，引物和 探针同时与目的基因片段结合，此吋探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧 光信号；而反应进行到延伸阶段时 ,Taq酶发挥5~3的外切核酸酶功能，将探针降解 。这样探针上的 1 GB/T 19438.2—2004 R基团游离出来，所发出的荧光不再 Q所吸