GB/T 19438.1-2004禽流感病毒通用荧光　RT-PCR　检测方法.pdf

GB/T19438.1-2004 月U 吕 GB/T19438-2004((禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分: — GB/T19438.1-2004((禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》; — GB/T19438.2-2004((H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; — GB/T19438.3-2004((H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; — GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A、附录C是规范性附录，附录B是资料性附录 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人:赖平安、张鹤晓、谷强、王甲正、周琦、杨伟、赖少梅。 GB/T19438.1-2004 禽 流 感 病毒 通 用 荧 光 RT-PCR 检 测 方 法 范围 本部分规定了禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法 本部分适用于活禽及其产品中禽流感病毒的检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本部分。 荧光RT-PCR 荧光反转录一聚合酶链反应 2.2 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的闽值时所经历的循环数 2.3 RNA 核糖核酸。 2.4 DEPC 焦碳酸乙二酉旨 2.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水(配方见附录A) 2.6 Taq酶 TaqDNA聚合酶。 3 原理 禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性 引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位 于引物结合区域内。探针的5’端和3端‘分别标记不同的荧光素，如5’端标记FAM荧光素，它发出的荧 光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团(用R表示),3’端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内 能吸收5端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团(用Q表示)。 当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针一上R基团发 出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号;当PCR反应进行到延伸阶段时， Taq酶在引物的引导下，以四种核昔酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链;当链的延伸 进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5-3外‘切核酸酶的功 能，将探针水解成单核昔酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再 GB/T19438.1-2004 不为Q所吸收而被检测仪所接收;在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链,R和Q基团均游 离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。 4 材料与试荆 4.1 仪器与器材 4.1.1荧光RT-PCR检测仪 4.1.2 高速台式冷冻离心机(离心速度 12000r/min以上)。 4.1.3 台式离心机(离心速度3000r/min). 4.1.4 混匀器 4.1.5 冰箱(2℃一8℃和一20℃两种) 4.1.6 微量可调移液器(10pL,100川-,1000川_)及配套带滤芯吸头。 4.1.7 Eppendorf管(1.5ml) 4.2 试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水 处理后高压灭菌)分装。 4.2.1 三氯甲烷。 4.2.2 异丙醇 :一20℃预冷 4.2.3 PBS:121℃士20C,15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各 10000IU/mL 4.2.4 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。 4.2.5 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒ll:组成、功能及使用注意事项参见附录Bo 5 抽样 5.1 采样工具