SZDB∕Z 313-2018 H5N6 亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测.docx

ICS11.220B41

SZDB/Z

深圳市标准化指导性技术文件SZDB/Z313—2018

H5N6亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法

Methodofthereal-timeRT-PCRfordetectionofsubtypeH5N6avianinfluenzavirus

2018-07-04发布2018-08-01实施

深圳市市场监督管理局发布

I

SZDB/Z313—2018

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4原理 1

5仪器与试剂 1

6生物安全要求 2

7样品采集和前处理 2

8核酸提取 3

9核酸提取 4

10分析条件设定 4

11结果判定 4

附录A（规范性附录）试常用剂配制 6

附录B（资料性附录）实时荧光RT-PCR反应体系配制 7

附录C（资料性附录）H5N6亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR典型扩增曲线图例 8

II

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前言

本文件按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本文件的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。本文件由深圳市检验检疫科学研究院提出。

本文件由中华人民共和国深圳出入境检验检疫局归口。

本文件起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心、深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心。

本文件起草人：刘建利、孙洁、曾少灵、秦智锋、曹琛福、廖立珊、卢体康、陶虹、张彩虹、詹爱军、林庆燕、陈书琨、吕建强、杨俊兴。

1

SZDB/Z313—2018

H5N6亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法

1范围

本文件规定了H5N6亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR的检测方法。

本文件适用于快速检测禽类咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、组织样品等临床样品中H5N6亚型流感病毒。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样

GB/T18936高致病性禽流感诊断技术GB19442高致病性禽流感防治技术规范GB19489实验室生物安全通用要求

3缩略语

CT值CYCLETHRESHOLD，反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数

DEPCDIETHYLPROCARBONATE，焦碳酸二乙酯

FAM6-CARBOXY-FLUORESCEIN，6-羧基荧光素

RT-PCRREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION,反转录聚合酶链式反应

4原理

采用TaqMan方法，分别选择H5N6毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列。采用DNAMAN软件对Genbank公布的所有序列进行Blast比较后，分别在各自的高度保守序列内进行引物和探针的设计。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中HA基因探针5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团，NA基因探针5’端标记HEX荧光，3’端均标记BHQ为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

5仪器与试剂

5.1仪器

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实时荧光PCR仪、高速冷冻离心机（最大转速15000r/min）、生物安全柜、混匀器、冰箱（2℃~8℃,-20℃,-80℃)、微量可调移液器（10μL,100μL,1000μL）、带滤芯吸嘴（10μL,100μL,1000μL）、灭菌研钵、离心管、PCR光学反应管。

5.2试剂

5.2.1试剂级别

除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682