细胞破碎和分离提取技术.ppt

小结一般常用的缓冲液都有现成的配方，可查阅相关参考书利用特定的缓冲液计算软件或者网上缓冲液计算软件：http://缓冲液的pKa值尽可能接近预期pH（pH±0.5）温度改变、溶液稀释及添加中性盐的情况下，缓冲液pH变化尽可能小缓冲物质不与实验中其他物质发生反应，不干扰实验的检测（eg.硼酸盐/糖蛋白，280nm处有光吸收）4.3AssaysforactivityandconcentrationMostproteinshavesomeformofuniquefunctionalactivity（具有一种活性）,whichdefinesthespecificprotein.Beforetheproteincanbeisolated,itisnecessarytoconceiveof(确定)anactivityandtodevise（设计）anappropriateassay.补充2Theactivityassayshouldbe:specific,todefinetheproteinofinterestanddistinguishitfromallothersquantitative,sothatthesuccessofthepurificationcanbemonitoredeconomicalintermsoftimeandmaterial.干扰素含量测定（MTT法生物学活性测定）原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。材料：?VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10％FCS?RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、酶标检测仪。活性定义：以保护半数(50％)Wish细胞免受病毒VSV损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。123尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白底物，在生物体内，它作用于精氨酸-缬氨酸键，使纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似，也具有酯酶的活力，可作用于N-乙酰甘氨酰-L-赖氨酸甲酯。对血纤维蛋白、血纤维蛋白原等都有溶解作用，从而达到溶血栓、抗凝血作用，所以是一种十分有效的溶血剂。在临床上，尿激酶已广泛应用于治疗各种新血栓的形成或血栓梗塞性疾病。3214尿激酶活性测定→机械法破碎会产生大量细胞碎片，胞内所有可溶性杂蛋白质释放，发酵液粘度增加等，而非机械破碎方法条件比较温和，有利于细胞内分布在膜附近的目标产物的高活力释放回收一定浓度甘油或蔗糖溶液EDTA：对于稳定G-细胞外膜的镁离子起破坏作用，导致外层膜不稳定或溶解，有机溶剂及表面活性剂均是对细胞膜的纸质成分有一定程度破坏而引起的Putanotherway,asolutionNaH2PO4willhaveapHlessthanpKa2andasolutionofNa2HPO4willhaveapHgreaterthanpKa2.醋酸/醋酸钠，pK2时，磷酸盐（磷酸氢二钠/磷酸二氢钠）磷酸二氢钠/磷酸氢二钠谁是酸？Tris－Cl？醋酸/醋酸钠；磷酸氢二钠/磷酸二氢钠；Tris－ClAsthereactionisdependentonthereductionofcupricionstocuprousionsbytheprotein,生化分离工程第四章细胞破碎和分离提取技术一般为，pH为7－8的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液（与细胞内环境相似）抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外界氧化环境。eg.二硫苏糖醇DTT，2-巯基乙醇2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH（还原型）PVP：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA，etc0102破碎缓冲液细胞破碎（Celldisruption）细胞的结构动物/植物和微生物：前者没有细胞壁，只有脂质和蛋白质构成的柔软的细胞膜，易于破碎细菌：革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁坚固Why？较难破碎。酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的