生物分离细胞破碎.ppt

第四章 微生物细胞破碎 二、细胞破碎方法 1、珠磨法 搅拌设计要能够给予研磨剂以最佳推动力，一般设计为搅拌盘。搅拌盘与驱动轴有同心的，也有偏心的；有垂直的，也有倾斜的。有的搅拌盘上有凹槽或是开度口以帮助搅拌。 2、高压匀浆法 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方程可表示为： 高压匀浆法— 适合于酵母和细菌的大规模破碎； 不适于丝状菌破碎。 4、超声波破碎 是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 破碎原理： 在高的输入声能下，液体各个成核部位会形成许多小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能再压缩时，气泡破裂，释放出猛烈的展波。这种震波通过介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大量声能被转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。 优点： 适合于多种细胞的破碎； 处理少量样品操作方便； 液体损失少； 破碎率高。 缺点： 有效能量利用率低，产热大，需控温（冰水或通冷却剂）； 不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎； 影响因素多：细胞种类、浓度、超声波的声频等。 优点： 选择性释放产物; 条件温和; 核酸泄出量少; 细胞外形完整。 缺点： 溶酶价格高; 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶）; 产物抑制的存在。 （3） 反复冻结—融化 可用于某些细胞的破碎，或释放某些细胞组分。冻结－融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低，即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。 三、目标产物的选择性释放 四、破碎率的测定 a. 直接测定 利用显微镜观察或计数；染色可将破碎细胞和完整细胞区分开。 如革兰氏染色能将破碎后的革兰氏阳性菌染成阴性菌的颜色； 受损的酵母细胞为亮红色，未受损的酵母细胞为紫色。 b. 测定释放的蛋白量或酶活 将破碎后的细胞悬液离心，测定上清液中蛋白浓度或酶活。 c. 测电导率 电导率随破碎率的增加而线性增加 五、细胞破碎的发展趋势 1、多种破碎方法相结合 化学法与酶法取决于细胞膜壁的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原理。 2、与上游过程相结合 （1）克隆噬菌体裂解基因 举例： 于慧敏等构建得到了一株具有λ噬菌体裂解基因的产PHB重组大肠杆菌，通过发酵后期升高温度至50℃保温2h，或者加入螯合剂EDTA，均可使细胞裂解释放出目标产物PHB。 （2）耐高温产品的基因表达 在破碎和分离过程中，为防止产品失活而消耗的制冷费是相当可观的。如果产品能表达成耐高温型，那么在较高的温度下进行操作既节省了冷却费用，又简化了分离步骤。 3、避开菌体破碎的方法 需要进行细胞破碎的前提是目标产物存在于细胞内，当目标产物可以在发酵过程中释放到胞外，则细胞破碎的操作即可省去。 毕赤酵母、枯草芽孢杆菌… Summary 细胞破碎常用方法：珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、X-press法、酶法、化学法、渗透压法、冻融法、干燥法； 细胞破碎率的测定方法； 细胞破碎与上下游联系。 处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。 EDTA螯合剂 酸碱 破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品 能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。 有机溶剂 变性剂 盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 变性剂与