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动物细胞培养实验流程
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CONTENTS
01
实验前期准备
02
细胞分离与处理
03
培养基配置要求
04
细胞培养过程控制
05
检测与分析技术
06
应用与保存规范
01
实验前期准备
实验材料清单确认
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确认所需细胞株种类、数量及传代次数。
细胞株
选用合适的血清种类和浓度，保证细胞正常生长。
血清
选择适合细胞生长的培养基，包括基础培养基和添加剂。
培养基
01
03
02
添加适当的抗生素和抗真菌剂，防止细胞污染。
抗生素和抗真菌剂
04
无菌操作环境搭建
实验室消毒
洁净工作台
无菌器材准备
操作人员消毒
使用高效消毒剂对实验室进行全面消毒，确保无菌环境。
确保洁净工作台内空气洁净度达到规定要求。
使用无菌器材进行实验，如无菌吸管、培养皿、离心管等。
操作人员需穿戴无菌衣帽、手套，并进行手部消毒。
仪器设备校准标准
培养箱
校准温度、湿度和CO2浓度，确保细胞生长环境稳定。
01
离心机
校准离心速度和时间，确保细胞分离效果。
02
显微镜
校准物镜和目镜的放大倍数，确保观察细胞时图像清晰。
03
移液器
校准移液器的精度和准确性，确保实验结果的可靠性。
04
02
细胞分离与处理
组织样本获取方法
从活体或新鲜组织中获取样本，用于细胞培养。
手术切取
通过穿刺或内窥镜等方式获取小块组织。
活检取样
已经建立的永生化细胞系或经过克隆筛选的细胞株。
细胞系或细胞株
酶消化法分离步骤
剪碎组织
终止消化
消化处理
离心分离
将获取的组织用手术刀或剪刀剪成小块，便于消化。
加入适当的消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶等，使细胞间质和细胞外基质降解，从而释放出单个细胞。
加入抑制剂或离心等方法终止消化，保护细胞免受过度消化损伤。
通过离心将细胞与消化液和其他杂质分离，获得细胞沉淀。
细胞悬液纯化技术
离心洗涤
用无菌的PBS或其他适宜的缓冲液洗涤细胞，去除残留的消化酶和其他杂质。
02
04
03
01
细胞计数与活力评估
使用细胞计数仪或台盼蓝等染色方法评估细胞数量和活力，确保细胞质量。
红细胞裂解
对于含红细胞较多的样本，需加入红细胞裂解液去除红细胞。
细胞筛选与纯化
通过细胞筛选、免疫磁珠分选等方法去除特定类型的细胞或杂质，获得纯度较高的细胞悬液。
03
培养基配置要求
基础培养基选择
平衡盐溶液
氨基酸和维生素
碳水化合物
生长因子和激素
模拟细胞外液环境，提供细胞生长所需的无机盐、葡萄糖和其他营养物质。
提供细胞合成蛋白质和核酸所需的氨基酸和维生素，有助于细胞生长和分裂。
如葡萄糖、果糖等，为细胞提供能量来源。
刺激细胞生长和分裂，如胰岛素、表皮生长因子等。
血清与添加物配比
血清选择
根据细胞类型和生长需求选择适宜的血清类型，如胎牛血清、新生牛血清等。
血清浓度
添加物
血清浓度过高可能会抑制细胞生长，过低则无法提供足够的营养和生长因子，一般根据细胞类型和实验需求进行优化。
根据实验需要添加抗生素、抗真菌剂、细胞生长因子等，以维持细胞健康和促进细胞生长。
1
2
3
pH值与渗透压调节
01
pH值调节
细胞对pH值非常敏感，过高或过低的pH值都会影响细胞生长和代谢。一般使用缓冲液来调节培养基的pH值，使其保持在适宜的范围内。
02
渗透压调节
细胞需要在等渗环境中才能维持正常的形态和功能，因此需要对培养基的渗透压进行调节。一般通过添加无机盐、糖类等渗透压调节剂来实现。
04
细胞培养过程控制
原代培养操作要点
选择适宜的动物组织，通过机械或酶解方法分离得到细胞，确保细胞活力和数量。
选材与处理
合理控制接种密度，避免细胞过密导致营养不足或生长受抑制。
接种密度
提供适宜的温度、湿度、气体环境（如氧浓度、二氧化碳浓度）以促进细胞生长。
培养环境
传代培养注意事项
培养液更换
定期更换培养液，以去除代谢产物和补充营养物质。
03
根据细胞种类和生长特性，确定合适的传代比例，以维持细胞活力。
02
传代比例
消化处理
使用适当的消化酶处理贴壁生长的细胞，以获得单细胞悬液。
01
污染监测与预防
无菌操作
培养液质量
定期监测
预防措施
严格遵循无菌操作规程，防止微生物污染。
使用高质量的培养液，避免污染和营养成分不足。
定期观察细胞形态和生长情况，及时发现并处理污染问题。
保持实验室环境整洁，定期消毒，使用专用器材和试剂，以减少污染风险。
05
检测与分析技术
细胞活性检测方法
台盼蓝染色法
利用活细胞能够排斥台盼蓝染料的特性，通过显微镜下观察细胞对染料的吸收情况来判断细胞活性。
MTT比色法
细胞克隆形成率测定
MTT能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，通过测定结晶物的吸光度来反映细胞活性。
将单个细胞悬液接种于培养皿中，培养一段时间后，统计