DB51T 1843-2014 猪A群轮状簿RT-PCR检测技术规范 .docx
ICS65.020.30
B41
DB51
四川省地方标准
DB51/T1843—2014
猪A群轮状病毒RT-PCR检测技术规范
2014-09-19发布2014-10-01实施
四川省质量技术监督局发布
I
DB51/T1843—2014
目次
前言 II
1范围 1
2规范性引用文件 1
3术语和定义 1
4设备和试剂 1
5RNA提取 2
6反转录 3
7PCR扩增 3
8PCR产物的电泳检测 3
9结果判定 3
10废弃物无害化处理 3
附录A(规范性附录)相关试剂的配制 5
II
DB51/T1843—2014
前言
本标准的附录A为规范性附录。
本标准由四川省农业厅提出并归口。
本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：西南民族大学。
本标准主要起草人：任玉鹏、岳华、汤承、张斌、张焕容、杨发龙、王远微。
1
DB51/T1843—2014
猪A群轮状病毒RT-PCR检测技术规范
1范围
本标准规定了猪A群轮状病毒RT-PCR检测方法。
本标准适用于猪只感染猪A群轮状病毒的检测、诊断和流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法
GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程
《兽医实验室生物安全技术管理规范》(2003农业部公告第302号)
3术语和定义
本标准采用下列术语和定义。3.1
猪A群轮状病毒groupAporcinerotavirus,GAR
猪轮状病毒(porcinerotavirus,PRV)是呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，基因组由11个节段的双股正链RNA组成；PRV主要包括A、B、E、C四个血清型，临床上猪只感染以猪A群轮状病毒(groupAporcinerotavirus,GAR)为主；
3.2
猪A群轮状病毒病
以猪A群轮状病毒为主要病原，引起剧烈呕吐、腹泻和脱水等为特征的人畜共患胃肠道传染病。
4设备和试剂
4.1主要仪器和设备
4.1.1PCR扩增仪
4.1.2电泳仪、水平电泳槽
4.1.3凝胶成像系统
4.1.4冷冻高速离心机
4.1.5微量高速离心机(适合于对PCR反应管进行离心操作)
4.1.6高压蒸汽灭菌锅
4.1.7涡旋仪
2
DB51/T1843—2014
4.1.8恒温水浴锅
4.1.9移液器(0.1μL～2.5μL、0.1μL~10μL、20μL～200μL、200μL～1000μL)
4.2主要试剂
4.2.1引物(10μmol/L)
P1:5-TCAAGCACGATTTGGAAC-3
P2:5-GCCTGGTGGAAATACTGGTC-3扩增片段长度274bp。
4.2.2变性液：见附录A.1。
4.2.32mol/L醋酸钠溶液(pH4.0):见附录A.2。
4.2.4水饱和酚(pH4.0)。
4.2.5氯仿/异戊醇(49/1)混合溶液。
4.2.6PrimescriptTMRT试剂盒
4.2.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。
4.2.81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.3。
4.2.950×TAE缓冲液：见附录A.4。
4.2.10核酸染料(Goldview)。
4.2.11DEPC处理的灭菌双蒸水：见附录A.5。
4.2.12异丙醇。
4.2.13DEPC处理的灭菌双蒸水配置的75%乙醇：见附录A.6。
4.2.142.5mmoldNTPs。
4.2.1510×PCR缓冲液。
4.2.166×上样缓冲液(6×LoadingBuffer)。
4.2.17DNA分子量标准DL600。
4.2.18水：所用水应符合GB/T6682中