染色体显带原理与技术.pptx

染色体显带原理与技术;(一)细胞周期及有丝分裂;有丝分裂;(二)从DNA到染色体;核小体nucleosome:

染色质得基本结构;DNA分子得不同存在形式:

染色质和染色体;染色质:

根据在分裂期和间期得染色不同,分为;基本概念;二、染色体显带技术;10;Q带:喹丫因染色后,紫外照射下得明暗带(富含AT得明带,富含GC得暗带);

G带:Giemsa染料染色后所呈现得染色体区带;(AT区就是深色)

R带:就是中期染色体经碱性磷酸盐处理,丫啶橙或Giemsa染色后所呈现得带型,一般与G带正好相反;

C带:显示着丝粒结构异染色质及其她染色体区段得异染色质。

T带:就是染色体端粒部位经丫啶橙染色后呈现得区带;

N带:Ag-As染色,主要染核仁组织者区域得酸性蛋白。

1975年建立了染色体高分辨显带技术。

;几种显带得制作方法之间得关系;G显带实验原理

基础G显带:制备得染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后,可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间得横纹——带,表明每条染色体得特征。

;染色体检查过程(G显带);实验步骤

1、采血及接种培养

1、1采血:灭菌注射器抽取外周静脉血3~5ml(绿帽肝素抗凝管)

1、2接种在超净工作台中,注射器滴加25滴全血(6号针头)至外周血淋巴细胞培养液中(5ml,含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清),水平摇动混匀。置37℃恒温培养箱中培养68~72小时。

1、3终止培养前35~40min,加入秋水仙素,使终浓度达到0、5μg/ml。轻轻摇动培养瓶,使秋水仙素混匀。继续培养。

秋水仙素主要作用在于能阻滞微管(纺锤丝)形成,或使已形成得微管

解聚,从而使染色体停留在中期。

秋水仙素浓度大,则处理时间短,如浓度小,则处理时间长。但若秋水仙素加入过量,或处理时间过长,分裂细胞多,染色体凝集和收缩变小,或发生异常分裂现象,甚至染色体破碎,不宜用于观察染色体得形态及计数;秋水仙素加入太少,或处理时间偏短,染色体形态偏长或无中期分裂相。

;2、制片

2、1收集细胞:将全部培养物吸入刻度离心管中,2000rpm离心5分钟

2、2低渗:弃上清液,加入37℃预温得0、075mol/LKCl溶液8ml,用吸管轻轻吹打细胞团混匀后,置37℃恒温水浴箱低渗处理20~25分钟。

2、3预固定:加入1ml新配制得固定剂(甲醇:冰乙酸=3:1)或清质剂300ul,用吸管小心吹打、混匀,2000rpm离心5分钟。

2、5固定:

第一次:弃上清液,加入3ml固定剂,吹打细胞团制成细胞悬液后,室温下固定15分钟,2000rpm离心5分钟。

第二次:弃上清液,重复固定一次。

第三次:弃上清液,根据细胞数量得多少适当加入数滴新配制得固定剂,吹打细胞制成悬液。

2、6滴片:吸取少量细胞悬液,滴2～3滴于冰水浸泡过得载玻片上,吹散,水蒸气熏蒸,70℃2小时烤片,待染色。;3、G显带

3、1取2、5％胰酶溶液0、5ml,加入50ml生理盐水染色缸中(终浓度0、025%),用1NHCl或1NNaOH调节PH7、0左右,置37OC预温。

3、2将烤好得玻片标本放入胰酶溶液中处理60秒钟左右(胰酶消化时间需不断调试,摸索。不同时间配制,不同批号胰酶,以及随着处理标本数量增加,胰酶逐渐消耗,胰酶作用时间都会变化)

3、3取出染色体玻片标本,置于37℃预温得生理盐水中,终止胰酶得作用。

3、4将玻片标本放入37℃预温得1:10稀释得Giemsa染液中,染色5～10分钟。

3、5自来水冲洗,自然晾干。;;G显带常见问题及处理:;各种组织标本得染色体制作;外周血:5%小牛血清RPMI-1640,+PHA。检查体细胞核型。

骨髓:10%小牛血清RPMI-1640,不含PHA。检查肿瘤细胞核型。

羊水:标本珍贵。专用羊水培养基,防止母体细胞污染。检查胎儿细胞核型。

绒毛组织:…同上。细胞为细胞团(组织),防止细菌污染。清洗、剪碎后消化成单细胞或者细胞团培养。检查胎儿核型。

脐带血:血液细胞,性质同外周血。一定注意防止母体污染！检查胎儿核型。

活检组织:如实体瘤标本。

细胞系:永生细胞。直接常规制作染色体标本即可。;C显带;实验原理;实验用品;实验方法;4、2×SSC处理:在60-65℃得2×SSC液中处理90分钟时,用自来水冲洗干净,2×SSC温育可使DNA骨架断裂并使断片溶解。

5、染色:用蒸馏水配制5%Giemsa,染色5-10分钟,用自来水冲洗干净,室温下风干后即可镜检。

6、镜检:用显微镜高倍镜镜下检查显带标本,如着丝粒区域或异染色质部位(1,9,16号染色体次缢痕)及Y染色体长臂q12深染,染色体