2014年1223 - 高通量测序技术在肿瘤诊断与治疗中应用.ppt

科研应用（潜在临床应用前景） 基于全外显子测序的家族遗传性肿瘤疾病易感性研究（以下以胃癌为例） 质控 标本采集：TRIO全血采集（与测序公司讨论所需血样体积），采用抗凝管 DNA提取（QIAmp DNA Blood Mini kit）及保存 （1）样品纯度：OD 260/280值应在1.8～2.0 之 间；RNA free。 （2）样品浓度：最低浓度不低于50ng/μl。 （3）样品总量：每个样品总量不少于15μg。 （4）样品溶剂：溶解在H20或TE （pH 8.0）中。 （5）保存：DNA低温运输（-20℃，干冰） 家族性胃癌是指： 高发病率区(如中国) 一级和(或)二级亲属中≥3例患病 其中1例是另2例的一级亲属 连续两代发病 至少有1例发病年龄＜50岁。 突破点在于： 1、发现罕见疾病家系 2、收集完整家族血液样本 3、剔除抑制突变、SNP及同义突变 4、发现新的突变SNPcopy number 肥胖与HP（+）胃癌的关系研究 胃癌（Gastric Cancer） 全球：第四大常见癌症；第二大癌症死亡率 平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女发病率2:1 中国：恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高 风险：家族遗传、HP、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等 家族遗传因素：肥胖和肿瘤是全球两大重要的公共卫生问题。 肥胖可以增加胃癌罹患率,并且治疗效果差、 肿瘤病死率高,但具体机制尚不清楚。 肥胖与胃癌均存在一定家族遗传性 全外显子捕获测序获得初筛数据 Step 1 Step 2 Step 3 先证者 母亲 父亲 DNA/RNA Extraction Next-generation Sequencing 数据库比对 SNV、indel analysis、mutant genes RT-PCR、IHC of target genes in tissues of proband 功能研究 Blood Samples In vitro/ vivo study 5 Trios with HP（+） Tissues TRIO家庭 三口之家 肥胖的定义 1.BMI: 25 kg/㎡ normal 25~30 kg/㎡ overweight 30kg/㎡ obesity 2.WHR or WHtR（waist-to-hip ratio or waist-to height ratio Male： 0.95 obesity Female：0.8 obesity 三人同时满足！ HP（+）的定义 胃镜取活检标本检查，分离培养+直接涂片检查+病理切片 未经任何治疗 胃癌的定义 胃镜取活检标本检查，病理检测 未经任何治疗 腺癌(包括乳头状腺癌、管状腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌) 先证者一人满足！ C14呼气试验能否确诊HP（+）？ 实验组 对照组 3-5 TRIOs 肥胖家庭 非肥胖家庭 HP（+） 外显子测序 普通测序验证 De Novo 突变 体外及动物实验 3-5 TRIOs HP（+） 外显子测序 普通测序验证 De Novo 突变 体外及动物实验 其他标准：性别比 TNM 分期 先证者年龄 中国测序论坛 * * 高通量测序技术在肿瘤诊断与个体化治疗中的应用 吴晨 肿瘤是一种基因病 基因过表达与突变 同病异突变 传统突变检测的局限性 NGS 测序的历史 高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。 High-throughput Sequencing Next Generation Sequencing Deep Sequencing 高通量测序简介（NGS） 文库扩增 低通量 Sanger测序 高通量测序 并行测序高通量 无需建立文库，两端加测序接头 PCR扩增 Exome sequencing Transcriptome sequencing Genome sequencing Targeted sequencing a: Roche/454, Life/APG, Polonator b: Illumina/Solexa Solid-Phase amplification