利用棋盘格实验直接筛选酶免疫测定的最佳包被抗原和抗体浓度.pdf

维普资讯 第 36卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 第9期 2008年9月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 1191～1195 利用棋盘格实验直接筛选酶免疫测定的 最佳包被抗原和抗体浓度 谭伟 明 何素平 张 蕾 赵洪伟 赵 静 李召虎 李学锋 王保民 Qingx．Li。 (中国农业大学理学院，北京 100094) (中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100094) (DepartmentofMolecularBiosciencesandBioengineering，UniversityofHawaii，Honolulu96822，USA) 摘 要 以两个单克隆抗体及其相应的包被抗原为例 ，研究了棋盘格实验中包被抗原与抗体浓度组合对免 疫检测中0孔吸光度值A。、Ic。值和标准曲线斜率的影响。结果发现，A。和 Ic。值随包被抗原与抗体稀释倍 数的增加而降低；斜率随抗体稀释倍数增加而降低 ，而随包被抗原的稀释倍数增加表现出先增加后降低的趋 势。在同一抗体浓度和不同包被抗原浓度的组合中，斜率最大值出现在使板吸附达到饱和的最大稀释倍数的 包被抗原浓度附近。综合实验结果确认从棋盘格实验中直接筛选最佳包被抗原、抗体浓度组合的标准是 ：选 择使板吸附达到饱和的最大包被抗原稀释倍数为最佳包被抗原浓度，在不同抗体浓度与已选择的最佳包被 抗原浓度组合中使 0孔吸光度值达 1．0左右的抗体稀释倍数为最佳抗体浓度。 关键词 酶联免疫吸附测定，棋盘格实验，方法优化 1 引 言 酶联免疫吸附测定(ELISA)是最为常用的免疫化学分析方法之一 ¨ ，现 已广泛应用于农药、兽 药、环境污染物、真菌毒素、植物激素和中药有效成分等小分子物质的快速检测 。 无论是直接、间接还是简化的间接竞争 ELISA J，各免疫试剂的浓度变化对检测性能存在十分重要 的影响。因此，选取最佳浓度的抗体和酶标半抗原或者选取最佳浓度的抗体与包被抗原的组合来建立 标准曲线就显得十分重要 。 对于 ELISA方法建立时各免疫试剂最佳浓度的选择 ，一般是通过棋盘格实验来进行 的。由于棋盘 格上所得到的是抑制孑L与0孑L的吸光度值，如何仅根据吸光度值来确定抗体与包被抗原的最佳稀释倍 数，从而达到最佳检测性能，还没有一个 明确的选择标准。已有的文献有如下4种选择方法：(1)以一 定时间的显色反应后，0孑L吸光度值在 1．0左右 J，且包被抗原稀释倍数尽可能大，而抗体稀释倍数尽 可能小的组合 ’ ；(2)以0孑L与抑制孑L的抑制率… 并结合0孑L的吸光度值来进行选择，即选择那些抑 制率大，0孑L的吸光度值在 1．0左右的组合；(3)以0孑L吸光度值在 1．0左右”。的包被抗原与抗体浓度 组合为基础 ，选择组合中标准曲线 Ic 值最小的组合；(4)以包被抗原在板上吸附达到饱和的最大稀释 倍数作为包被抗原浓度，而抗体稀释倍数则选择在此包被抗原浓度下0孑L吸光度值达到 1．0的稀释倍 数 ¨ 。本实验室在包被抗原与抗体最佳稀释倍数的选择上通常采用的是以0孑L与抑制孑L吸光度值 的差值尽量大，而抑NTL吸光度值尽可能小的经验方法 。 本实验 以两个单克隆抗体及其相应的包被抗原为例，研究间接竞争EL1SA棋盘格实验 中包被抗原 与抗体浓度组合对免疫检测中0孑L吸光度值 Ic蜘值和标准曲线斜率的影响，同时评价已有的根据棋 盘格实验选择酶免疫测定中最佳包被抗原与抗体浓度标准的合理性 。 2 实验部分 2．1 试剂及仪器 甘草酸(glycyrrhizinicacid，GL)、异戊烯基腺嘌呤核苷 (isopentenyladenosine，iPA)、辣根过氧化物酶 200712-01收稿 ；2008-04—14接受 本文系国家高技术研究发展计划(863)基金资助项 目(No．2001AA249061) E—mail：waEg【baomin@ Cal1．edu．CII