第章固相膜免疫测定.ppt

第一节 概述 一、常用的固相膜 二、固相膜的技术要求 第二节 胶体金免疫技术 一、胶体金的特性 二、胶体金的制备 三、免疫金制备 一、胶体金的特性 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒组成：基础金核（原子金Au）+双离子层（内层为负离子层AuCl2-、外层是带正电荷的H+，分散在溶液中）。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态。 胶体金特性： 1、胶体特性 1-100nm，胶体特性（对电解质敏感） 2、呈色性和光吸收性 胶体金颗粒大小不同，呈色不同，光吸收性不同 3、稳定性 介于小分子离子溶液和粗分散相之间，影响三因素：相互吸引力（远近）、带电情况、溶剂膜的斥力 4、聚沉现象 引起聚沉因素：电解质、温度、浓度 2、方法 制备时加入不同剂量的柠檬酸钠可获得不同粒径的胶体金颗粒。 3、注意事项 4、鉴定与保存 鉴定项目：粒径大小、均一程度、有无凝集（混浊或有漂浮物） 玻璃容器、室温避光、无灰尘环境3个月，避免低温冻存。 2、技术要点 胶体金溶液PH的调整：接近蛋白质的PI或偏碱 蛋白质浓度的确定： 金标记物的纯化：除去未标记的蛋白、未充分标记的胶体金、聚合物 3、注意事项 ELISPOT结果判断 免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称为Westernblot。免疫印迹法（图）分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），第二阶段为蛋白质转运（电转移），第三阶段为酶免疫测定（HRP、二氨基联苯胺显棕色、4-氯-1-萘酚显蓝紫色）。 五、免疫印迹法——Westernblot法 原理 Westernblot——抗原表位可能被破坏而漏检 大纲要求 掌握：胶体金标记技术、胶体金、免疫金等的概念，膜载体免疫测定的种类与基本原理。 熟悉：固相膜的特点与种类。　 了解：胶体金的制备，免疫金制备，其他。 你知道吗？ 颗粒性抗原在什么情况下会自凝？ 抗体制剂的保存何种形式保存最久？ 纯化单克隆抗体最好的方法是？ 单扩结果出现双环其原因是？ 免疫电泳时，常用琼脂糖凝胶的浓度是？ 免疫电泳的用途？ 小 结 固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析试验、斑点ELISA 、酶联免疫斑点试验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。 思考题 1. 叙述固相膜免疫测定概念。 2．膜的种类与特性是什么？ 3．膜载体免疫测定的种类有哪些？ 4．斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)的原理是什么？ 5．免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）的原理是什么？ 6．斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 原理是什么？ 7．酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 原理是什么？ 8．免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 原理是什么？ 9．免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 注意事项是什么？ 10．放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 原理是什么？ 第十二章　固相膜免疫测定 第三节 膜载体免疫测定的种类与原理 一、免疫渗滤试验 二、免疫层析试验 三、斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 四、酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 五、免疫印迹法 （IBT） 以固相膜作为载体的免疫快速检测试验，最大特点是不需要大型设备，易掌握操作要求和判定标准。 　第一节 概述 微孔膜作为固相，特点： 多孔性 穿流（似滤纸）与横流（毛细管作用） 非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性 易于漂洗 操作简便 标志