双向电泳的技术流程和样品制备.ppt

聚丙烯醯胺凝膠和轉印到膜上的蛋白質的檢測理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩定（stability）：相容性（synergy）：二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統中無需濃縮膠，因為在IPG膠條中蛋白質區域已得到濃縮，可以認為非限制性IEF膠（低濃度丙烯醯胺膠）充當了濃縮膠。聚丙烯醯胺凝膠和轉印到膜上的蛋白質的檢測理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩定（stability）：相容性（synergy）：雙向電泳的技術流程和樣品製備基因組學與蛋白質組學基因組學：蛋白質組學：可視為分子生物學的大規模篩選技術，目的在於歸類細胞中的蛋白質的整體分佈，鑒定並分析感興趣的個別蛋白，最終闡明它們的關係與功能。上述兩種學科的研究內容在互補的水準上研究了細胞的分子架構，又都在各自的水準上提供了增強對方效應的資訊，因此二者存在有很強的且帶有系統性相互關係。Applicationsofproteomics

?Proteinidentification/characterization?Protein-proteininteraction?Post-translationalmodifications?Subcellularlocation?Elucidationofpathway?Targetvalidationandtoxicology?Drugdiscovery蛋白質組分析的首要要求將來自於全細胞、組織或生物體中所包含的多達幾千種混合蛋白質進行分離、檢測和分析。2-DE技術依然是大多數蛋白質組研究中分離複雜蛋白質混合物的首選技術。生物學問題的提出實驗模型的設計實驗組和對照組樣品的製備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點的切取胰酶對脫色後蛋白質的消化質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜結果的生物資訊學分析和比對新蛋白質的發現其他實驗的進一步驗證蛋白資訊的初步獲得蛋白質組研究的基本技術路線蛋白質樣品的製備雙向電泳圖像分析轉印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質品質N端測序肽序列質譜數據肽指紋圖數據搜索新的或已知蛋白蛋白轉錄後修飾的鑒定雙向電泳分析中的樣品製備製備原則：應使所有待分析的蛋白樣品全部處於溶解狀態（包括多數疏水性蛋白），且製備方法應具有可重現性。防止樣品在聚焦時發生蛋白的聚集和沉澱。防止在樣品製備過程中發生樣品的抽提後化學修飾（如酶性或化學性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。儘量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。可溶性樣品固體組織樣品細胞不同樣品的基本處理方法樣品的分級處理通過採用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉澱等方法對蛋白質樣品進行分級處理，可降低樣品的複雜性並富集低豐度蛋白質。當前最簡單有效的處理是採用分級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質的最關鍵因素之一。溶解的目標：1、樣品中非共價結合的蛋白質複合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結合牢固的蛋白複合物可能使2-DE中出現新的蛋白點，相應的表示單個多肽的點的強度會下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態。增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變溶液中的氫鍵結構使蛋白質充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經過變性劑處理而暴露蛋白質的疏水基團後，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或?-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進行還原。起載體作用的兩性電解質：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質也需要在鹽離子的作用下才能保持其處於溶解狀態，否則這些蛋白質在其處於PI點時會發生沉澱。Carrierampholytes的作用在於捕獲樣品中的少量鹽分，從而保