单克隆抗体的制备及应用2010.ppt

* 說明文字 脾的大小，粘连情况 * 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，胸腺嘧啶核苷激酶 * 为什么要换液，为什么要半量换液 * 单细胞生长不具备生长优势 * 细胞内DNA的生物合成途径 主要生物合成途径 补救途径 甲氨喋呤 次黄嘌呤 次黄嘌呤核苷酸 HGPRT+ TK+ 胸腺嘧啶 胸腺嘧啶 脱氧核苷酸 DNA 小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0） 融合后的细胞在HAT选择培养基中结局 Sp2/0 + B Sp2/0 Sp2/0 B B Sp2/0 B 死亡 死亡 存活 B. 荧光流式细胞仪分选（FACS法） 两种颜色荧光素分别标记两种融合细胞 异硫氰酸荧光素（FITC） 罗丹明 筛选同时有两种荧光素的融合细胞 所筛细胞直接接种96孔板 融合后的管理 换液 Day 3：半量换液 Day 7：半量换液 观察融合细胞生长状况，有无细胞克隆的出现 检测 一个高倍视野大小 检测上清 间接法 筛选阳性孔入24孔板扩增 固 定 相 抗原 2 E 亚克隆 软琼脂克隆法 有限稀释法(常用) ：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞 m m 1 1 4 4 3 3 2 2 4 2 4 4 4 2 3 3 3 2 4 4 4 4 4 2 2 2 4 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 亚克隆细胞的培养 添加饲养细胞：胸腺细胞 提高血清浓度：20% 添加细胞因子：IL-6，胰岛素 多次亚克隆（2-3次） 确保每个孔中只有来自于一个细胞的克隆群 淘汰核型不稳定的克隆，获得稳定基因型和稳定分泌抗体的克隆 扩增培养、冻存细胞 四、单克隆抗体的大量获得与纯化 小鼠腹水诱导 细胞培养上清 饱和硫酸铵沉淀 (40%) 离子交换法 (DEAE) 胶体过滤法 (Sepharose) 亲和层析法 (Protein A、G) 纯 化 方 法 体外培养 培养上清中的牛血清影响纯化效果 逐步降低培养基中血清浓度 20%-10%-5%-2.5%-1%-0 把握时机 专用无血清培养基 生物反应器（Bioreactor） 体内培养 小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞，诱导含有大量单克隆抗体的腹水 将对数生长期杂交瘤细胞洗涤后重悬于无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液中注射 接种前一周需用降植烷处理小鼠腹腔，抑制腹腔免疫系统，有益于杂交瘤接种 抗体效价高，但可能被小鼠自身抗体污染 实 验 内 容 腹腔注射 小鼠眼眶取血 处死小鼠 原代细胞的分离、培养 腹腔注射： ①用左手拇指和食指紧紧抓住颈部背的皮肤，手掌成杯状紧握鼠背，同时用小指压住尾根，固定好动物 ②抬高小鼠腹部，右手将注射器的针头刺入左下腹皮肤 ③针尖通过腹肌后抵抗力消失，固定好针尖，缓缓注入液体 ④为避免刺破内脏，可将小鼠头部放低，尾部抬高，使脏器移向横膈处 小鼠眼眶采血： 先将鼠倒持，压迫颈部，使眼球突出充血，酒精棉球局部消毒，用毛细管或塑料管沿眼角向后、下方插入眼底静脉丛，血可从毛细管中自然流出 脾细胞分离： ①拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中消毒体表 ②用剪刀依次剪开小鼠腹部皮肤和腹膜，暴露腹腔，取出脾脏，剃除周围结缔组织和脂肪，无血清培养液冲洗一次后置于100目不锈钢网中 ③轻轻研磨脾脏，并用无血清培养液冲洗，收集脾细胞悬液，以1000rpm 离心5min，弃上清，重悬浮于不完全培养液中 谢 谢 细胞计数 血细胞计数板 血细胞计数板的构造 计数室的划格 计数室充液法 细胞计数顺序 计算方法 镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细 胞只计左侧和上方的。 计算公式：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000注意：镜下若见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。 19世纪，白喉杆菌培养上清中分离得到毒素，注入动物引起典型白喉发病。白喉和破伤风毒素免疫动物后，血清中产生一种中和毒素的物质，能阻止疾病引发。将这种动物源性的抗毒素血清用于感染的患儿，明显治疗效果。将这种物质称为抗毒素，抗体。抗体的定义随着技术的发展几经更迭，直到上世纪70年代，世卫组织统一，沿用至今。具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称免疫球蛋白，结构概念。抗体是功能概念 * 抗原表面蛋白很多，一个抗体一般只与一部分反应。 * 抗原表位图，如何诱发B细胞活化、克隆，引出多抗的概念 * 多克隆抗体：抗体发现的过程即为多克隆抗体制备的过程，免疫动物获得抗血清。也一直是获得抗体的经典方法，直到75年单抗技术的产生。介绍抗原表位 * 多抗单抗多为动物源性，用于人的治