第三章 酶工程固定化酶与固定化细胞_提纲_2016.pdf

第三章 固定化酶与固定化细胞 3.1 酶的固定化 3.1.1 概述 1）固定化酶的源流 (1)1916 年 Nelson 和 Griffin 发现酶的固定化现象。 (2)1953 年，德国 Grubhofer 和 Schleith 将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与 羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶共价结合制成最早的固定化酶。 (3)1969 年，日本的千畑一郎首次用固定化氨基酰化酶拆分 DL-酰化氨基 酸。第一个工业应用的固定化酶。 (4)固定化酶 immobilized enzyme 是 1971 年在美国举行的第一次国际酶工程 会议上推荐确定的。又称水不溶性酶、固相酶。 2）什么是固定化酶？ 固定化酶：在一定空间内处于闭锁状态并能发挥催化作用、可重复利用的 酶。 3）固定化酶的优点 ①多次使用，单位酶的生产力提高 ②与底物、产物易分开，简化提纯工艺，提高产率和产品质量 ③可以装柱或装塔连续反应 ④较游离酶更适合于多酶反应，应用范围广 4）固定化酶的缺点 ①增加了生产的成本，工厂初始投资大 ②固定化时，酶活力有损失 ③胞内酶必须经过酶的分离程序 ④只能用于水溶性小分子底物，对大分子底物不适宜 ⑤与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别需要辅因子的固定化技术 3.1.2 固定化酶的性质及其影响因素 1、影响固定化酶性质的因素 1）酶本身的变化 主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 2）载体的影响 （1） 分配效应 1 载体的亲水或者疏水特性以及带电特征使底物、产物或其它效应物在固定化 酶所处微观环境和宏观体系间发生不等分配 （2） 空间障碍效应 载体成为底物或者其它效应物结合到活性中心或变构中心的空间障碍 （3） 扩散限制效应 底物、产物和其它效应物在酶的微环境区与宏观体系之间迁移和运转速度受 到限制 3）固定化方法的影响 2、固定化后酶性质的变化 1）固定化后酶活力的变化 ： 酶活性下降。 2）增加酶的稳定性：对热、pH 值、有机溶剂、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶 的稳定性增加。连续化反应稳定性好——固定化酶的最大好处 3）最适 pH 的改变 ? 最适 pH 和酶活力-pH 曲线常常发生偏移，若载体带负电荷，pH 向碱性 方向移动；若载体带正电荷，pH 向酸性方向移动。 ? 微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。 ? 产物性质对固定化酶最适 pH 的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适 pH 要比游离酶的高；反之则 低。产物为中性时，最适 pH 一般不改变。 4）最适温度改变 由于固定化后酶的热稳定性提高，所以最适温度一般也随之提高。 5）底物特异性变化 ? 作用于低分子底物的酶，底物特异性没有明显变化 e.g. 氨基酰化酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶 ? 既可作用于大分子底物又可作用于小分子底物的酶，底物特异性往往会 变化。 e.g. 胰蛋白酶 6）动力学常数的改变 米氏常数 Km 的变化：Km 值随载体性质变化 ? 载体与底物带相反电荷，静电作用，KmKm ? 载体与底物带相同电荷，Km Km 3、 评价固定化酶的指标 1）固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位数。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位数（酶膜、酶管、酶板）。 2）操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测定条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2） 3）