6 酶学与酶工程 第六章 酶的固定化[精].ppt

交联法的优点是操作简便，其缺陷则是交联反应的过程往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。 1) 采用某些保护措施 2) 尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间，有利于固定化酶比活力的提高。 5.热处理法 6.各种固定化酶方法的优缺点比较 1．酶的活性 2．酶的稳定性 固定化增加了酶活性构象的牢固程度 抑制酶的自身降解 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭 固定化酶稳定性升高表现在以下方面 固定化增加了酶的耐热性 固定化增大了酶对变性剂、抑制剂的抵抗能力 固定化减轻了蛋白酶的破坏作用 固定化可以增强贮存稳定性和操作稳定性 3．酶的最适温度 4．酶的最适pH 5．酶的动力学特征 6．酶的作用专一性 1．酶的活力 固定化酶(细胞)的活力即是固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。 固定化酶(细胞)的单位可定义为：每毫克干重固定化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 测定方法分为间歇测定和连续测定两种 1)间歇测定 在搅拌或振荡反应器中，与溶液酶同样测定条件下(如均匀悬浮于保温的介质中)进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常规酶活测定方法进行测定。 2)连续测定 将固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液。 2．蛋白总量 (1)双辛可宁酸法(BCA法) (2)考马斯亮蓝法 3．偶联率及相对活力 偶联率＝(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)／加入 蛋白活力X100％ 活力回收＝固定化酶总活力／加入酶的总活力×100％ 相对活力＝固定化酶总活力／(加入酶的总活力一上清液中未偶联酶活力)X100％ 4．半衰期 固定化酶(细胞)的半衰期是指在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。 被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。 一、 固定化细胞的特点 具有固定化酶的特定，同时又具有自身的优势： 固定化细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好 保持了细胞内的酶系统、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制 发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间 固定化细胞密度提高，可以提高产率 提高固定化工程菌的质粒稳定性 缺点： 必须保持菌体的完整，防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度 必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解 胞内多酶的存在，会形成副产物 载体、细胞膜或细胞壁会造成底物扩散的障碍等 二、固定化细胞的分类 分类方法 类型 细胞类型 微生物、植物、动物 生理状态 死细胞；完整细胞，细胞碎片，细胞器 活细胞：增殖细胞，静止细胞 饥饿细胞 三、细胞固定化方法 1．包理法 操作简便 包埋条件温和 形成的凝胶有一定的机械强度 2. 吸附法 四、固定化细胞的性质 一方面固定化对酶产生的某些影响同样对细胞起作用 由于细胞内环境的相对恒定和细胞的“缓冲作用”，固定化对细胞胞内酶产生的影响在某些方面不像对游离的自然酶那样明显 固定化细胞(内)酶除受固定化因素影响外，还受细胞结构及细胞膜透性的影响。 五、固定化细胞发酵产酶的特点 1．提高产酶率 2．可以反复使用或连续使用较长时间 3．基因工程菌的质粒稳定不易丢失 4．发酵稳定性好 5．缩短发酵周期，提高设备利用率 6．产品容易分离纯化 7．适用于胞外酶等胞外产物的生产 一、固定化酶（Immobilized Enzyme） 1. 定义：固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学的方法处理，使之成为不溶于水的，但是仍具有生物活性的酶。催化反应后的酶可以回收重复使用。 固定化酶优点： 极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺； 可以在较长时间内进行反复分批反应和连续反应，酶的使用效率提高，成本降低； 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 酶反应过程能够加以严格控制； 较游离酶更适合于多酶反应； 可以增加产物的收率，提高产物的质量。 。 固定化酶的缺点： 由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率损失； 由于固定化需用载体，因而多了载体成本费及固定化操作费用； 固定化酶颗粒的扩散阻力会使反应速率下降； 只能用于可溶性底物和小分子底物，对大分子底物不适宜。 必须注意维持酶的催化活性及专一性 应该有利于生产自动化、连续化 应有最小的空间位阻 酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮存，利于反复使用 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物，产物或反应液发生化学反应 固定化酶成本要低，以利于工业使用 酶的固定化：采用各种方法