K5裂解酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析.PDF

696 高金卉 等/K5 裂解酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology June 25, 2012, 28(6): 696−704 /cjbcn ©2012 Chin J Biotech, All rights reserved 工业生物技术 K5 1 1 1 1 1 1,2 高金卉 ，窦文芳 ，李会 ，张晓梅 ，许泓瑜 ，许正宏 1 江南大学医药学院制药工程研究室，江苏 无锡 214122 2 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122 高金卉, 窦文芳, 李会, 等. K5 裂解酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析. 生物工程学报, 2012, 28(6): 696−704. Gao JH, Dou WF, Li H, et al. Expression, purification and characterization of K5-lyase in Escherichia coli . Chin J Biotech, 2012, 28(6): 696−704. 摘 要: K5 多糖裂解酶 (Elma) 能够裂解半合成肝素的底物-K5 多糖，裂解产物是半合成法生产低分子量肝 素的底物。利用PCR 方法扩增elma ，构建表达载体pET-28a-Elma ，将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21 中， 以0.2 mmol/L 的IPTG 在 16 ℃诱导5 h 实现了高效表达，SDS分析表明Elma 表达量可达菌体总蛋白的 30 ％以上。采用Ni2+-NTA 亲和层析法和G-75 分子筛层析纯化目的蛋白，其纯度大于 95 ％。通过PAGE 多糖 电泳发现裂解前后的K5 多糖分子量有明显的减小。根据Elma 裂解产物产生双键从而在232 nm 处有吸光度的 变化来测Elma 的酶活。其最适反应温度为37 ℃，反应的最适pH 值为 7.0 。底物特异性分析发现Elma 除K5 多糖外对肝素和透明质酸也有降解作用。 关键词: 大肠杆菌，K5 多糖，K5 裂解酶，表达，纯化 Expression, purification and characterization of K5 lyase in Escherichia coli 1 1 1 1 1 1,2 Jinhui Gao , Wenfang Dou , Hui Li , Xiaomei Zhang , Hongyu Xu , and Zhenghong Xu 1 Laboratory of Pharmaceutical Engineering, School of Medicine and Pharmaceutics, Jiangnan University , Wuxi 214122, Jiangsu , China 2 The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University , Wuxi 214122, Jiangsu, China Abstract: K5 polysaccharide of high molec